Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 3

Bolsista: Maria Eduarda Alves de Medeiros
Orientador(a): ALZIRA MARIA PAIVA DE ALMEIDA
Resumo: A peste, infecção causada pela bactéria Yersinia pestis, é uma zoonose, principalmente associada aos roedores, transmitida pela picada de pulgas infectadas. Sob certas condições, pode afetar outros mamíferos, incluindo os seres humanos. Desde a chegada da peste ao Brasil em 1899, durante a última pandemia, tem sido implementado um programa de vigilância e controle adaptado à situação epidemiológica, às características ecológicas e demográficas e às condições científicas e tecnológicas. Inicialmente, o diagnóstico era baseado exclusivamente em exames bacteriológicos, mas com o tempo, foi introduzido o teste sorológico para detectar anticorpos específicos antipeste (anti-F1) por meio de hemaglutinação (HA) em animais sentinelas, como cães, gatos e algumas espécies de roedores nas áreas de foco. Os resultados mostraram que o teste sorológico era mais sensível nos cães domésticos, e a vigilância se concentrou na análise das amostras sorológicas desses animais. Desde 2007, o monitoramento de roedores e pulgas foi descontinuado. Embora não tenham sido registrados casos humanos desde 2005 no Brasil, a circulação da infecção na natureza continuou a ser monitorada por meio da vigilância sorológica, mesmo anos após as últimas ocorrências. No entanto, a qualquer momento, os focos podem voltar à atividade, mesmo após longos períodos de inatividade, especialmente durante a transição epidemiológica global. Além disso, os focos naturais tendem a se expandir, aumentando o risco para a população humana. Nesse sentido este estudo busca entender a dinâmica da infecção para a construção de cenários de risco de transmissão e identificar períodos e locais que necessitam de maior atenção das autoridades de saúde pública, a fim de direcionar as atividades de vigilância nessas áreas. Como se trata de pesquisa documental no acervo do SRP o projeto não tem implicações éticas e dispensa autorizações.

Bolsista: AMANDA FERREIRA DE ARAUJO LOURENCO
Orientador(a): ANTONIO CARLOS SIANI
Resumo: A classe química dos terpenos, tem revelado importantes moléculas utilizadas na quimioterapia do câncer (ex: taxol(Marca Registrada) ). O presente projeto é focado nos triterpenos que constituem as cascas de maçãs, onde predominam o ácido ursólico (AU) e ácido olenólico (AO), complementados por triterpenos menores e ácidos graxos eventualmente hidroxilados na cadeia carbônica. Esses ácidos triterpênicos respondem por um sem-número de estudos pré-clínicos, nos quais se destacam a capacidade anti-inflamatória, citotóxica e imunomoduladora.Resumidamente, o objetivo do projeto consiste em (i) promover uma extração seletiva dessa matéria-prima, buscando concentrar ao máximo as substâncias-alvo representadas por ácidos triterpênicos; (ii) otimizar a separação dos ácidos triterpênicos utilizando Extração em Fase Sólida (EFS) e escalonar o processo por Cromatografia de Média Pressão (CMP) com foco na mistura binária; (iii) ensaiar a purificação do AU majoritário aplicando a técnica de complexação do AO com iodo, visando separá-lo ainda usando CMP; e (iv) esterificar o AO para obter seu éster metílico derivado (ursolato de metila), que constituirá a amostra a ser testada quanto à atividade anticâncer in vitro.A realização dessas etapas constitui a base do projeto mais amplo, e elas já foram iniciadas pelo bolsista PIBITI predecessor, que executou testes para as etapas (i)-(iii). O trabalho atual consiste na reprodução da etapa (ii), cujo know-how já foi estabelecido, visando acumular material suficiente para avançar no projeto; na otimização da etapa (iii) e avanço no escalonamento por CPM. Com estabelecimento dos parâmetros para a purificação do AU em quantidade de gramas. O escopo do projeto é completado pelos ensaios de um processo de esterificação viável do AU, para o qual há uma única descrição na literatura, de execução onerosa. Para tal, o padrão da substância metilada advirá da metilação do AU com diazometano, cujo preparo está no escopo das atividades laboratoriais.O ursolato de metila será testado quanto à citotoxicidade in vitro para linhagens tumorais, com investigação da indução de morte celular. Paralelamente, será testada a atividade do AU purificado das cascas de maçãs, nos mesmos protocolos. A comparação das performances estabelecerá o nível de translacionalidade do projeto de aproveitamento das cascas de maçãs com finalidade medicinal.

Bolsista: FELIPE CORTEZ MARCOLINO
Orientador(a): Guilherme Ferreira Silveira
Resumo: Desenvolvimento de modelos de aprendizado profundo para prever a toxicidade aguda de novos compostos em roedores. O estudo foi realizado no Instituto Carlos Chagas, parte da Fundação Oswaldo Cruz, e a pesquisa aborda a complexidade do desenvolvimento de novos fármacos, destacando a importância da avaliação de toxicidade aguda antes dos ensaios clínicos em humanos. A toxicidade aguda sistêmica é crucial para determinar a dose letal 50 (DL50), que indica a dose que pode causar efeitos adversos após uma única exposição. Para otimizar essa avaliação, o estudo utiliza inteligência artificial e aprendizado de máquina, empregando modelos computacionais para prever características de novos compostos. As redes neurais artificiais (RNAs) são destacadas pela sua capacidade de modelar relações não lineares e extrair características relevantes de dados complexos. O objetivo geral do projeto é desenvolver um modelo de QSAR para predição de DL50 de compostos em roedores, visando reduzir custos, tempo e o uso de animais em experimentação. A metodologia envolve a preparação de dados toxicológicos, a construção de modelos preditivos e a avaliação de desempenho dos modelos. Os resultados indicam que os modelos construídos apresentaram desempenhos distintos em relação à acurácia por categoria toxicológica, com destaque para o algoritmo de fingerprint Morgan quantitativo8. As conclusões sugerem que o modelo de maior eficácia foi o de redes neurais levando em consideração o organismo rato com administração intravenosa.

Bolsista: JOANA DO NASCIMENTO FERREIRA
Orientador(a): GILBERTO SALLES GAZETA
Resumo: O avanço contínuo da população humana sobre áreas de mata, incluindo reservas florestais, tem modificado os cenários epidemiológicos da Febre Maculosa (FM) em regiões anteriormente consideradas indenes. Assim, quanto maior a intervenção antrópica nas proximidades ou até mesmo no interior de áreas protegidas, mais intenso será o processo de degradação ambiental, favorecendo o estabelecimento de novas interações parasitárias. Nesse contexto, uma preocupação frequente é o risco de transbordamento zoonótico, fenômeno recentemente evidenciado com a pandemia do COVID-19, ressaltando a importância de estudos aprofundados sobre bioagentes presentes em ectoparasitos de animais silvestres. Essas pesquisas são essenciais para compreender não apenas as interações entre parasitos e hospedeiros, mas também os bioagentes envolvidos nos ciclos enzoóticos, os quais podem ser transportados por ectoparasitos que infestam animais sinantrópicos, facilitando a circulação desses agentes entre ambientes naturais e urbanos. Diante desse panorama, o presente estudo tem como objetivo avaliar aspectos bioepidemiológicos da ectoparasitofauna de roedores e marsupiais, em áreas de maior e menor altitude do Parque Nacional de Itatiaia (PNI), relacionando-os à circulação de rickettsias. Entre outubro de 2021 a junho de 2022, pequenos mamíferos foram capturados no interior da mata do PNI. Os ectoparasitos coletados estão sendo triados e identificados. A detecção e caracterização de Rickettsia será realizada pela extração e amplificação de DNA genômico por reação em cadeia da polimerase (PCR) e análise por eletroforese. Os fragmentos amplificados serão purificados e sequenciados, as sequências obtidas serão editadas e comparadas em percentual de identidade com aquelas disponíveis no GenBank. Posteriormente, serão geradas árvores filogenéticas para análise evolutiva dos agentes detectados. Até o momento foram triados e parcialmente identificados um total de 987 ectoparasitos, distribuídos em 755 ácaros (76,49%), 150 carrapatos (15,20%), 73 pulgas (7,40%) e 9 piolhos (0,91%). Entre os ácaros, a maior frequência relativa foi da família Laelapidae (93,77%), corroborando os achados anteriores em estudos com pequenos mamíferos. Também foram identificados três ácaros das famílias Macronyssidae (0,40%) e dez da Dermanyssidae (1,32%), as quais incluem espécies importantes, cuja participação nos ciclos enzoóticos e epidêmicos das rickettsioses tem sido assinaladas. Entre os carrapatos, o gênero Ixodes foi o mais frequente com 129 (86%) espécimes coletados, seguido de Haemaphysalis com 12 (8%) e Amblyomma com 04 (2,67%); cinco (3,33%) espécimes ainda não foram identificados. Esses achados são relevantes, uma vez que os carrapatos da família Ixodidae são os transmissores de patógenos para animais vertebrados e os principais veiculadores de rickettsias patogênicas do grupo febre maculosa para humanos. Ixodes longiscutatus (Boero, 1944) foi observado em roedores do PNI, apontando para um possível aumento no padrão de distribuição deste carrapato no país. Entre os Siphonaptera, Hechtiella lakoi, com 33 espécimes coletados (45,20%), foi a espécie mais frequente, sendo observada somente em Trinomys gratiosus. Trabalhos anteriores evidenciaram a ocorrência de H. lakoi em roedores Nectomys squamipes e principalmente em T. gratiosus, apontando para a hipótese de que essa pulga tenha predileção parasitária por esta espécie de roedor, o que pode ter importância para o ciclo enzoótico de microrganismos. Ainda em Siphonaptera, destacamos o encontro de espécimes de Ctenocephalides, potencialmente vetor de Rickesttsia felis, sabidamente patogênica. A ordem Phthiraptera foi aquela com menor número de exemplares encontrados, mas com ao menos um espécime hematófago (Anoplura) detectado, o que aponta para a possibilidade de ciclo enzoótico.

Bolsista: SAMUEL CAVALCANTE FILHO
Orientador(a): RUBEM FIGUEIREDO SADOK MENNA BARRETO
Resumo: A doença de Chagas é uma importante doença parasitária causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. A OMS estima que aproximadamente sete milhões de pessoas sejam portadoras dessa doença em todo mundo, e mais de 100 milhões vivam sob risco de infecção. A doença de Chagas também é considerada uma das 13 Doenças Tropicais Negligenciadas mais importantes. A autofagia é um processo catabólico de organelas não-funcionais e/ou macromoléculas, em que ocorre a reciclagem de componentes celulares redundantes e danificados. Apesar dos efeitos benéficos, a autofagia exacerbada também pode levar à morte da célula. Essa via é altamente conservada e regulada, com os genes relacionados à autofagia (ATGs) tendo sido identificados distribuídos em todos os eucariotos. Em T. cruzi, análises de bioinformática revelaram a existência de genes associados à expansão do fagóforo e a formação do autofagossomo, indispensáveis para o sistema de conjugação da Atg8, sendo eles ATG3, ATG4, ATG7 e ATG8. A participação da autofagia já foi estabelecida durante a metaciclogênese do T. cruzi (processo de diferenciação de epimastigotas em tripomastigotas metacíclicos). Também já foi demonstrado que a metaciclogênese pode ser modulada por fármacos que atuam na via autofágica: a presença de indutores, como a rapamicina e a espermidina, levou ao aumento da detecção de autofagossomos, enquanto inibidores, como a wortmanina e a bafilomicina, diminuiram o fluxo autofágico. Por outro lado, a ferroptose é uma forma de morte celular distinta de apoptose, necrose e autofagia, caracterizada pelo acúmulo de ferro citoplasmático. O excesso de ferro, não associado a outras moléculas, aumenta a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), através da reação de Fenton. Esse processo leva a danos nas membranas celulares, através da peroxidação lipídica, e redução no volume mitocondrial, com diminuição ou desaparecimento das cristas mitocondriais. Nos tripanosomatídeos, a ferroptose foi descrita apenas em T. brucei, levando a danos na fisiologia mitocondrial, aumento na produção de ROS e peroxidação lipídica decorrentes do acúmulo de ferro. Em um trabalho prévio, nosso grupo descreveu alterações mitocondriais entre epimastigotas e tripomastigotas sanguíneos. Essas alterações são consistentes com uma pré-adaptação dos parasitos à disponibilidade de substratos energéticos e, também, às condições oxidativas encontradas na célula hospedeira. Em tripomastigotas metacíclicos também foi descrita, em comparação com as outras formas evolutivas do parasito, maior abundância de enzimas antioxidantes (incluindo as localizadas na mitocôndria) e do catabolismo de carboidratos. Apesar desses dados, ainda não se sabe como a autofagia participa do remodelamento mitocondrial desencadeado pelos processos de diferenciação do parasito. O T. cruzi é incapaz de sintetizar heme e a demanda por essa molécula e pelo ferro também é extremamente variável durante seu ciclo de vida. Além disso, tanto o heme quanto o ferro representam um importante desafio oxidativo para o parasito, uma vez que as formas epimastigotas colonizam o trato digestivo o triatomíneo, um inseto hematófago, e as formas tripomastigotas necessitam sobreviver no sangue antes de infectar a célula hospedeira. Sendo assim, é plausível que a ferroptose influencie na sobrevivência do parasito e na dinâmica de infecção da célula hospedeira. Até o momento, observamos que epimastigotas controle e DeltaATG3 apresentaram perfil semelhante de resistência a hemina e aos doadores de Fe2+, com valores de IC50/24 h superiores a 1,5 e 20 mM, respectivamente, assim como ao inibidor do complexo III do sistema de transporte de elétrons mitocondrial (antimicina A), com valores de IC50/24 h na faixa de 200 µM. Nos próximos passos são quantificar os níveis intracelulares de heme e ferro, bem como analisar as defesas antioxidantes, remodelamento mitocondrial, fluxo autofágico e ferroptose por diferentes abordagens.

Bolsista: Cleber dos Santos Cruz Junior
Orientador(a): Leonardo Paiva Farias
Resumo: Mundialmente, estima-se que mais de 10 milhões de pessoas estejam infectadas pelo HTLV-1, e cerca de 1% deles vão desenvolver leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL), uma doença com baixa sobrevida associada (menos de 2 anos). Desta forma, a oncogênese associada à infecção pelo HTLV-1 necessita de novas abordagens de tratamento com potencial de cura, haja vista que não existe terapia com a capacidade de eliminar o HTLV-1 do organismo infectado atualmente. Este projeto propõe a aplicação de um sistema multiplex de edição gênica baseada em CRISPR-Cas9 como uma nova alternativa eficaz aos tratamentos atuais para a ATLL. Nossa abordagem baseia-se na utilização de múltiplos RNAs guias que direcionarão a proteína Cas9 para clivar três regiões alvos do genoma do HTLV-1: as LTRs 5 e 3, além das regiões gênicas HBZ e Tax. O objetivo é desativar o genoma proviral através de mutações direcionadas, promovendo a inativação do vírus e prevenindo o escape viral. No presente trabalho, foram realizadas etapas que incluíram a validação experimental da edição gênica singleplex nas regiões-alvo LTRs 5 e 3, Tax e HBZ do genoma do HTLV-1, bem como o delineamento teórico do sistema multiplex de edição gênica. Além disso, foi realizado o desenho de uma modificação no vetor de transferência utilizado no sistema multiplex a fim de otimizá-lo ao substituir o marcador de resistência fluorescente por um marcador de resistência a antibiótico por meio de processos de digestão e clonagem. Os resultados experimentais indicaram que a edição gênica singleplex apresentou eficiência, com uma taxa de indels nas regiões-alvo próxima a 7% após 22 dias de cultivo celular. A literatura sugere que a combinação de guias validados num sistema singleplex aplicados em um sistema multiplex pode potencializar a inativação do genoma proviral e consequentemente a eficiência da edição, reduzindo a probabilidade de escape viral. Esse sistema representa uma ferramenta valiosa para pesquisas relacionadas a HTLV-1 e ATLL, além de oferecer novos conhecimentos em novas abordagens terapêuticas.