Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 3

Bolsista: GUSTAVO AUGUSTO FONSECA NOGUEIRA
Orientador(a): Vanessa Peruhype Magalhães Pascoal
Resumo: AVALIAÇÃO DO PERFIL FENOTÍPICO (ATIVAÇÃO E CITOTOXICIDADE) DE CÉLULAS MAIT NA COINFECÇÃO LV/HIV A leishmaniose visceral (LV) é uma doença tropical negligenciada, e, em Minas Gerais, um dos três estados brasileiros mais acometidos pela infecção, a taxa de letalidade foi de 10,34% em 2024. Embora grande parte das pessoas infectadas em áreas endêmicas seja assintomática, pacientes que desenvolvem sintomatologia clínica, apresentam febre prolongada, hepatoesplenomegalia e pancitopenia e, uma vez não tratada, a doença é fatal. Como agravante, tem sido observado aumento da coinfecção com o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), decorrente da sobreposição epidemiológica. Diante disso, a cronicidade da coinfecção LV/HIV é intensificada pela replicação aumentada dos patógenos, bem como por uma resposta imunológica predominantemente do tipo TH2 (com citocinas IL-10 e TGF-Beta), e perda de marcadores de memória em células T CD4 e CD8. É essencial que haja equilíbrio das respostas pró-inflamatória, reguladora e dos eixos TH17/TH22 para o controle das doenças. Outras células do sistema imunológico têm sido estudadas em doenças infecciosas e parasitárias. Nesse sentido, crescem os estudos que relatam o papel de linfócitos T não convencionais (células Tgd, NKTs e MAIT) na imunomodulação em diferentes infecções, em geral, dotados de uma rápida resposta à ativação antigênica e memória efetora. Essas características despertaram, em nosso grupo, o interesse em estudar essas células, especialmente, as células MAIT. Assim, este trabalho busca compreender o perfil fenotípico das células MAIT (TCRVAlpha7.2+CD161+) e nMAIT (TCRVAlpha7.2+CD161-) na LV e coinfecção LV/HIV, e analisar, no contexto ex vivo, os perfis de ativação/coestimulação e citotoxicidade a partir de marcadores específicos. Para isso, o estudo foi composto por pacientes com LV clássica; coinfectados LV/HIV; grupo HIV controlado; LV/HIV em profilaxia com Anfotericina B Lipossomal (LHP); e indivíduos não infectados (NI) para ambas as infecções. As amostras de sangue periférico foram incubadas com o mix de anticorpos, seguidas de lise dos eritrócitos e ressuspensão dos pellets. A leitura foi feita no citômetro de fluxo LSR Fortessa(Trade Mark) Cell Analyzer, enquanto, as análises, no software FlowJo(Trade Mark) . A partir da análise dos dados, foi observado que os grupos LV e LV/HIV obtiveram frequência reduzida de células MAIT e nMAIT circulantes em comparação com os grupos NI e LHP, fenômeno que pode sugerir migração para tecidos infectados e perda de capacidade proliferativa. Menor frequência de células MAIT CD8+ e nMAIT CD4+ foi observada nos grupos LV e LV/HIV. Por outro lado, LV/HIV e LHP registraram maiores frequências de nMAIT CD8+. E o grupo LV, comparado a NI, registrou maior frequência de MAIT CD4-CD8-, células com perfil mais pró-apoptótico e menos funcional. Em relação à ativação/coestimulação, comparado a NI, foi possível observar maior expressão de CD28 por MAIT CD4+ em LV e LV/HIV, de CD69 e CD38 por MAIT CD8+ em LV, e de CD38 por MAIT CD4-CD8- em LV e LV/HIV. O grupo LHP, em contrapartida, registrou diminuição na expressão de CD69 e CD38 por MAIT CD4+ e CD8+, e de CD69 e CD28 por MAIT CD4-CD8-, em relação a LV e coinfectados. Já para atividade citotóxica, foi possível conferir aumento de NKG2D e CD107A para a maioria das subpopulações MAIT e nMAIT do grupo LHP, comparado a LV e LV/HIV. Esses achados sugerem possível efeito modulador da Anfotericina B, uma vez que no grupo LHP observou-se aumento de citotoxicidade, associado à redução da ativação celular em relação aos grupos LV e LV/HIV, que apresentam quadro de cronicidade e, mesmo com alta ativação celular, há perda de função efetora. Portanto, no contexto da coinfecção, conferimos que houve impacto exercido sobre o perfil fenotípico de células MAIT e nMAIT, sugerindo a participação dessas células no controle/evolução da doença.

Bolsista: MARIA EDUARDA BARRETO DIAS
Orientador(a): Andre Luiz Franco Sampaio
Resumo: O câncer é uma doença na qual as células têm suas características alteradas apresentando proliferação descontrolada, podendo se espalhar para outras regiões do corpo. O câncer de mama é a principal causa de morte de câncer em mulheres no mundo (OMS, 2022; INCA, 2022; SCHWARTZ, 2024). A transição epitélio-mesenquimal é um importante processo para propagação metastática de células tumorais e ocorre quando as células perdem características epiteliais, e adquirem um fenótipo mesenquimal. Algumas proteínas são conhecidas como marcadores transição epitélio-mesenquimal (EMT): E-caderina, N-caderina e a Vimentina (FORONI et al., 2011; YEUNG et al., 2017). Moléculas bioativas de origem natural são utilizados na terapêutica do câncer ou inspiraram o arsenal atual de fármacos [2]. Os vitanolídeos aurelianolídeo A e aurelianolídeo B, extraídos e isolados das folhas de Athenaea fasciculata var. fasciculata, são moléculas esteroidais que possuem 28 moléculas de carbono, caracterizadas e descritas primariamente por possuírem atividade biológica leishmanicida (LIMA et al., 2018) e recentemente o nosso grupo demonstrou atividade antitumoral dos aurelianolídeo A e aurelianolídeo B em células leucêmicas (SILVA, 2023).Neste trabalho avaliamos a citotoxicidade dos aurelianolídeos nas células MCF-7 em modelos bidimensionais e modelos tridimensionais e na expressão de proteínas relacionadas a transição epitélio-mesenquimal. A cultura de células 3D em esferoides imita tumores sólidos em sua arquitetura, servindo como método alternativo ao uso de animais, promovendo ensaios mais rápidos e econômicos acelerando a PD&I de insumos para a saúde. A metodologia usada para a produção dos esferoides foi o método da suspenção forçada, utilizando placas de ultra-baixa adesão celular. A citotoxicidade foi realizada pelo método do MTT (72h) e a análise de expressão de proteínas pelo método Western Blotting. Na avaliação da citotoxicidade por MTT, ambos vitanolídeos foram capazes de inibir o crescimento das células de mama de forma satisfatória. No modelo 2D, na concentração de 100µM, os aurelianolídeos A e B apresentaram 80% de capacidade de inibição para a célula MCF-7, possivelmente atingindo um platô de inibição. É importante destacar que a partir da concentração de 12,5µM o aurelianolídeo A já apresenta um efeito máximo de inibição de 80%, com IC50 de 2,85µM e se mostrou mais potente em relação ao aurelianolídeo B que teve um valor de IC50 de 4,20µM. No modelo 3D ambos os vitanolídeos foram capazes de inibir o crescimento das células MCF-7 acima de 30% a partir das concentrações 6,25µM para o aurelianolídeo A e 12,5µM para o aurelianolídeo B, com valore de IC50 35,37 e 30,61 µM respectivamente. Foi realizado o Western Blotting para avaliar a expressão de proteínas da transição epitélio-mesenquimal. Observamos que a E-Caderina não apresentou alteração na expressão após o tratamento com os aurelionídeos A. Porém, o tratamento com o Aurelionídeo B na concentração de 7,0microM induziu uma diminuição na expressão da E- Caderina. Observamos uma diminuição da expressão da Vimentina e N-caderina na maioria dos tratamentos nas células MCF-7, com exceção do Aurelionídeo A 2,5microM onde observamos um aumento. Os nossos resultados sugerem os vitanolídeos testados foram capazes de inibir a proliferação da linhagem MCF-7 e apresentam boas chances de serem eficazes na modulação da propagação metastática por alterarem proteínas da transição epitélio mesenquimal.

Bolsista: THAYANE XAVIER DE ANDRADE
Orientador(a): MARTA DE ALMEIDA SANTIAGO
Resumo: A leishmaniose tegumentar americana (LTA) constitui um grave problema de saúde pública em regiões endêmicas, especialmente na América Latina. A heterogeneidade clínica da doença e a imprevisibilidade da resposta ao tratamento têm sido fortemente associadas às particularidades da resposta imunológica do hospedeiro frente à infecção por diferentes espécies do gênero Leishmania. Neste contexto, o presente estudo propõe uma abordagem inovadora centrada na investigação das armadilhas extracelulares (extracellular traps ETs), com potencial papel na modulação da resposta inflamatória e no controle da infecção. Com base em evidências recentes, as ETs têm se mostrado elementos-chave no contexto de infecções crônicas, autoimunes e parasitárias, incluindo as leishmanioses. A proposta do projeto concentra-se na caracterização fenotípica e funcional de armadilhas extracelulares formadas por neutrófilos (NETs) e linfócitos (LETs), induzidas in vitro por antígenos de Leishmania braziliensis (Lb) e Sporothrix spp. (Sp), para posterior correlação com o quadro clínico dos pacientes. A metodologia adotada se baseia em protocolos de citometria de fluxo multiparamétrica aplicados a amostras de sangue total e a células mononucleares de sangue periférico (CMSP), obtidas de pacientes acompanhados no INI/FIOCRUZ. As análises buscam avaliar parâmetros como degranulação, morte celular, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e extravasamento de DNA, utilizando marcadores como CD107a, Zombie Aqua, DHR e TOPRO-3 Iodide. Foram padronizadas estratégias de aquisição e análise por citometria de fluxo capazes de permitir a distinção simultânea de populações celulares e dos processos funcionais associados à liberação de ETs. As análises realizadas até o momento permitiram concluir que a inclusão dos marcadores CD66b e CD62L ao protocolo anteriormente utilizado, foi fundamental para uma identificação mais precisa dos neutrófilos em amostras de sangue total, reduzindo significativamente a interferência de outras populações celulares na detecção das NETs. Contudo, a introdução de novos fluorocromos impôs desafios técnicos relacionados à compensação espectral e à definição adequada dos controles, o que demanda uma padronização mais rigorosa para garantir a reprodutibilidade e confiabilidade da técnica citofluorimétrica. Além disso, a estratégia de avaliação de armadilhas extracelulares por meio da marcação com o reagente TOPRO associada à citometria de fluxo mostrou-se eficaz também na detecção de LETs, inclusive em células mononucleares congeladas por mais de cinco anos, que mostraram preservar sua viabilidade e os marcadores fenotípicos essenciais. Os antígenos Sp e Lb, previamente utilizados para indução de NETs, demonstraram capacidade de estimular a liberação de LETs, com manutenção da integridade celular, o que reforça sua aplicabilidade nos ensaios funcionais. Por outro lado, estímulos clássicos como PMA e CD3/CD28, frequentemente utilizados como controles positivos em outras abordagens, não induziram de forma eficiente a formação de armadilhas extracelulares nas condições experimentais estabelecidas, revelando-se inadequados para os objetivos deste estudo.

Bolsista: PEDRO ANIBAL NUNES BRITO
Orientador(a): VIVIANE SAMPAIO BOAVENTURA DE OLIVEIRA
Resumo: Objetivo: O objetivo deste projeto é avaliar se houve alteração no número de hospitalizações preveníveis relacionadas com diabetes mellitus (DM) após a pandemia de COVID-19, medindo a mudança de comportamento e predizendo o retorno à normalidade (pré-pandemia). A hipótese é de que a proporção de hospitalizações por causas preveníveis de DM aumentou durante e após a pandemia em comparação ao período anterior. Justificativa e relevância: A diabetes mellitus é uma doença crônica altamente prevalente na população brasileira (10,2%)1 que requer cuidados contínuos e adequados para prevenir complicações graves, como retinopatias, neuropatias e amputações por infecção. No entanto, a pandemia de COVID-19 pode ter impactado negativamente o cuidado e monitoramento constante, bem como a adesão ao tratamento e a progressão da doença nos indivíduos diagnosticados, por conta de possíveis alterações no acesso aos serviços de saúde, no seu estilo de vida (dieta e redução de atividade física) e no seu nível de estresse. É necessário, então, a avaliação desse impacto no número de complicações preveníveis da diabetes durante e após a pandemia. Essa informação pode ser útil para preparação e alerta adequado dos sistemas de saúde que poderão organizar-se para essa demanda com referências estatísticas sólidas dessas variações. Metodologia: Esse é um estudo retrospectivo de séries temporais para avaliação da variação do número de hospitalizações preveníveis relacionadas com diabetes mellitus no Brasil após a emergência da pandemia da COVID-19, a partir de dados provenientes de bancos públicos brasileiros. Foram coletados dados do SIH/SUS, realizando-se uma busca por causas primárias de hospitalização que estejam relacionadas às complicações preveníveis de DM. Os dados foram coletados e tabulados de acordo com ano, região, quantidade de procedimentos aprovados, cidade residência, idade, sexo, necessidade de UTI e duração da hospitalização. Para analisar as variações ao longo do tempo, foram feitas séries temporais interrompidas, com análise mensal do número de hospitalizações realizadas para cada complicação. Também foi realizada uma estratificação das AIHs em faixas etárias para modelagem. Resultados: Foram coletadas 95.753.563 AIHs referentes ao período de 2016-2023, sendo que 856.619 dessas continham o desfecho selecionado com CIDs que representam complicações de DM. Foram feitas as séries temporais geral e estratificadas e feita a modelagem com um modelo linear generalizado com distribuição de Poisson. O período durante a pandemia foi associado a uma redução significativa na taxa de hospitalizações por DM (IRR = 0,679 (95% IC 0,679-0,743) p < 0,001), enquanto a fase pós-pandêmica foi associado com um aumento (IRR = 2,000 (95% IC 1,109-3,607) p = 0,021). O efeito para cada mês (slope effect) em cada fase da pandemia foi diferente, enquanto durante a pandemia esse efeito foi positivo (IRR = 1,004 (95% IC 1,003-1,006) p < 0,001), indicando um aumento na taxa de hospitalizações após o declínio inicial. Os modelos testados mostram significância ao analisar o impacto da pandemia aumentando o número de hospitalizações por complicações preveníveis de DM. É possível que essa análise já possa ser levada em consideração para a produção de futuras intervenções e soluções em termos de políticas públicas de saúde, nos alertando para impactos da pandemia no tratamento de outras patologias que não a COVID-19.

Bolsista: MARIANA PUZER REGIS
Orientador(a): RAQUEL LIMA DE FIGUEIREDO TEIXEIRA
Resumo: A N-acetiltransferase 2 humana (NAT2), codificada pelo gene NAT2, é uma enzima de biotransformação de fase II e desempenha um papel significativo na depuração e/ou ativação de muitos fármacos e carcinógenos. NAT2 é um gene polimórfico e mutações na região codificante são capazes de alterar a atividade de acetilação da enzima caracterizando fenotipicamente os indivíduos em acetiladores lentos, intermediários ou rápidos. Considerando a influência dos polimorfismos de base única (SNPs Single Nucleotide Polymorphisms) na resposta aos medicamentos, este trabalho aparece no campo da famacogenética e da medicina personalizada, com o intuito de compreender como as variações no gene NAT2 geram diferentes fenótipos de acetilação que podem impactar diretamente na resposta terapêutica e no risco de toxicidade as drogas. No Brasil, alguns estudos mostraram a diversidade alélica de NAT2, com a descrição de SNPs e alelos novos com efeito funcional ainda desconhecido. Ensaios de modelagem e análise estrutural in silico da proteína NAT2 foram capazes de sugerir o papel estrutural e/ou funcional de seis polimorfismos raros identificados na população brasileira: c.152G>T, c.203G>A, c.458C>T, c.578C>T, c.683C>T e c.838G>A. Todos esses polimorfismos parecem influenciar na atividade de acetilação contribuindo para o fenótipo de acetilação lenta no Brasil, entretanto esses dados precisam ser confirmados através da análise funcional dessas variantes proteicas em sistemas de expressão heterólogos. A partir disso, o projeto tem como objetivo avaliar o efeito funcional desses seis polimorfismos no fenótipo de acetilação e o mecanismo pelo qual causam esse efeito. Neste contexto, foram realizadas até o momento, importantes etapas para a construção dos plasmídeos recombinantes contendo as mutações de interesse (inicialmente c.203G>A e c.803A>G). Elas foram geradas por meio da técnica de mutagênese sítio-dirigida baseada na PCR. Após essa amplificação, seguida de digestão e ligação, os DNAs recombinantes foram submetidos a transformação em Escherichia coli (E. coli) DH5-Alpha eletrocompetentes. Posteriormente, foram selecionadas colônias de cada transformação, realizada a extração plasmidial e, assim, a presença do gene NAT2 e das mutações introduzidas foram confirmadas por enzimas de restrição e sequenciamento de Sanger. Após análise das sequências, constatou-se a inserção das mutações em 100% dos clones. Para dar continuidade ao trabalho, será realizada a transformação dos plasmídeos em cepa de expressão de E. coli BL21 pLys, seguida da produção e purificação das proteínas NAT2 recombinantes. Além disso, serão realizados ensaios de Western blot, quantificação dos níveis de proteína, testes de atividade enzimática e estabilidade térmica. A caracterização do papel funcional de variações na sequência de NAT2 contribuirá para o melhor conhecimento da relação entre o fenótipo e o genótipo da enzima e para um planejamento terapêutico adequado em determinadas doenças que usam medicamentos metabolizados por NAT2.

Bolsista: PEDRO HENRIQUE COUTO DOS SANTOS
Orientador(a): Tatiany Patricia Romão Pompilio de Melo
Resumo: O vírus Chikungunya (CHIKV) constitui uma ameaça contínua à saúde pública, em virtude de sua elevada transmissibilidade e da ampla distribuição geográfica de seus vetores artrópodes. Isso reforça a necessidade de estratégias inovadoras para contenção viral, bem como para o desenvolvimento de ferramentas eficazes de controle entomológico, terapias antivirais e vacinas. A compreensão dos mecanismos de infecção do CHIKV em células de vetores é fundamental, entretanto, ainda são escassos os estudos que investigam a biogênese viral em diferentes linhagens celulares de insetos. Neste estudo, foi realizada uma análise comparativa da infecção pelo CHIKV nas linhagens celulares C6/36 (derivada de Aedes albopictus) e Sf9 (derivada de Spodoptera frugiperda). A replicação viral foi avaliada por meio de RT-qPCR, imunofluorescência indireta, detecção direta de partículas virais e análise de alterações ultraestruturais utilizando microscopia eletrônica de transmissão (MET). Ambas as linhagens demonstraram ser suscetíveis e permissivas à infecção pelo CHIKV. Inicialmente, a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT, permitindo a identificação dos valores de multiplicidade de infecção (MOI) mais eficazes para realização dos ensaios in vitro, os quais também foram correlacionados à presença de efeitos citopáticos dos cultivos celulares. A cinética de replicação foi avaliada por PCR em tempo real, com quantificação da carga de RNA viral em diferentes tempos pós-infecção (24, 48, 72 e 96 hpi), tanto no sobrenadante (vírus maduro) quanto nos sedimentos celulares (vírus imaturos). A linhagem Sf9 apresentou maior concentração de RNA viral nos sedimentos em todos os tempos analisados, sugerindo acúmulo intracelular de vírions imaturos. Em contraste, a linhagem C6/36 demonstrou um padrão de replicação mais uniforme entre sobrenadante e sedimento, com pico de liberação de partículas virais no sobrenadante em 48 e 72 hpi, seguido por redução significativa em 96 hpi. Esses dados indicam que a C6/36 favorece uma produção mais eficiente e liberação extracelular de partículas virais maduras, enquanto a linhagem Sf9 apresenta retenção intracelular do RNA viral ao longo da infecção. As análises ultraestruturais por MET revelaram alterações características da infecção viral, incluindo a formação de autofagossomos, corpos multivesiculares, estresse do retículo endoplasmático e vesículas associadas à replicação viral, assim como a detecção dos estágios de maturação do vírus. Em células C6/36, observou-se a indução de estruturas relacionadas à via autofágica a partir de 48 horas pós-infecção, evidenciada por imunomarcação da proteína LC3B e confirmada por Western-blotting. Em contraste, essa resposta não foi detectada nas células Sf9, sugerindo que o CHIKV pode seguir rotas alternativas de replicação ou evasão celular nesse modelo. Os resultados obtidos, especialmente no que diz respeito à linhagem Sf9, ainda inexplorada nesse contexto, fornece novos insights sobre a biogênese e o ciclo replicativo do CHIKV em hospedeiros invertebrados. Esses achados ampliam o conhecimento sobre as interações arbovírus-vetor e oferecem suporte para o desenvolvimento de abordagens no controle da transmissão vetorial e reforçam o potencial da linhagem Sf9 como modelo in vitro alternativo para estudos relacionados a biologia de arbovírus.