Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 2

Bolsista: CLAUDIA LUCIANA DOS SANTOS MOURA
Orientador(a): ROBERTA OLMO PINHEIRO
Resumo: A hanseníase é causada por Mycobacterium leprae ou M. lepromatosis. Caracteriza-se como um bacilo álcool ácido resistente, que tem tropismo por macrófagos e células de Schwann no nervo periférico, sendo uma das principais causas de neuropatia em todo o mundo. A neuropatia periférica pode afetar os nervos motores, sensitivos e autonômicos e, embora a poliquimioterapia (PQT) seja iniciada imediatamente após o diagnóstico, muitas das vezes o acometimento neural já se encontra em curso. O dano neural pode ocorrer nas diferentes formas clínicas da doença e pode ser consequência direta da interação da bactéria com a célula hospedeira ou da inflamação resultante da infecção. Entre os pacientes com a forma multibacilar da hanseníase, encontram-se os que apresentam grande risco de desenvolvimento de neuropatias, uma vez que este polo é caracterizado por indivíduos com alta carga bacilar (multibacilares - MB), resultante de uma resposta imunológica mediada por células ineficaz. Estima-se que 30 a 60% destes pacientes apresentem dano difuso no nervo periférico no momento do diagnóstico, que continua progredindo mesmo após o uso da PQT e corticosteróides. A neuropatia no paciente multibacilar evolui de forma silenciosa e quando o paciente apresenta os sintomas, já apresenta uma lesão irreversível, de modo que a identificação de marcadores preditivos de dano neural em pacientes multibacilares torna-se uma estratégia prioritária de enfrentamento às incapacidades. Até o momento, não há testes laboratoriais que possam auxiliar no diagnóstico precoce da doença, havendo uma demanda para a identificação de marcadores séricos que possam ser utilizados no desenvolvimento de um kit diagnóstico. Nosso grupo tem desenvolvido algumas linhas de pesquisa focando no estudo de mecanismos de imunopatogênese associados com a neuropatia hanseniana. Os inflamassomas são complexos proteicos envolvidos na resposta imune inata e em um tipo de morte celular conhecido como piroptose. Os inflamassomas favorecem a maturação das citocinas, interleucina (IL)-1Beta e IL-18, por clivagem através da caspase 1. Um dado de microarranjo, publicado por nosso grupo, avaliou a modulação da expressão gênica em células de Schwann primárias infectadas com M. leprae, sugere que a infecção induz a regulação positiva de genes da via de inflamassomas, como NLRP1, CASP5, PYCARD e CARD8. A partir destes dados esta linha de pesquisa segue com pespectivas e perguntas buscando complementar o entendimento do papel dos inflamassomas no dano neural. Diversos estudos envolvendo patologias do sistema nervoso central apontam que as quinureninas produzidas pela degradação do triptofano podem ter uma função neurotóxica, mas pouco se sabe sobre o envolvimento de IDO1 e seus metabólitos no sistema nervoso periférico. A via das quinureninas degrada o aminoácido essencial – triptofano – em diversos metabólitos neuroativos, entre os quais podemos destacar a quinurenina, o ácido quinurênico e o ácido quinolínico. A primeira reação metabólica é mediada pela Indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO1), sendo esta induzida por citocinas pró-inflamatórias. Pouco se sabe sobre a interação da via de inflamassomos com a via das quinureninas, mas em modelo de infecção com Toxoplasma gondii foi mostrado que IL-1Beta produzido de monócitos em uma maneira dependente de antígenos do parasito e inflamassoma NLRP3, combinado com IFN-Gamma pode estimular a produção de iNOS, levando à redução dos níveis de IDO1. Dados anteriores mostram um aumento na atividade de IDO1 em células de lesão de pele e no soro de pacientes com a forma multibacilar da doença quando comparado com amostras de pacientes paucibacilares ou indivíduos sadios. Nos pacientes com hanseníase, a atividade de IDO1 está associada com o aumento de IL-10 e se correlaciona com o bloqueio de autofagia. O bloqueio da via autofágica em células de pacientes multibacilares está associado com o desenvolvimento de reação reversa, um episódio inflamatório agudo que pode ocorrer durante o curso clínico da doença e que está associado com o incremento do dano neural. Diante disso, o entendimento sobre a capacidade de M. leprae modular a via das quinureninas nas células de Schwann é necessário para entender a patogênese da doença e avaliar possibilidades de estratégias e intervenções para o diagnóstico precoce, ajudando na prevenção das incapacidades, assim como para iniciar estudos de fármacos que auxiliem no tratamento da neuropatia hansênica, melhorando os sintomas e impedindo a progressão do dano neural.

Bolsista: GABRIELA LOUISE DA SILVA MOREIRA
Orientador(a): CLAUDIA MAGALHAES CALVET ALVAREZ
Resumo: Justificativa e Relevância. O tratamento da doença de Chagas é limitado às drogas benzonidazol e nifurtimox, que apresentam eficácia variável na fase crônica da infecção e causam severos efeitos colaterais tóxicos. Assim, a busca por drogas mais efetivas e menos tóxicas continua sendo um desafio atual. Derivados de piperina e butenolídeos, compostos sintetizados a partir de produtos naturais, mostraram atividade tripanocida promissora e merecem avançar no pipeline de desenvolvimento de drogas1,2. Em paralelo, o composto SRPIN340 e derivados, inibidores seletivos de quinase serina-arginina 1/2, são candidatos para serem avaliados contra o T. cruzi, que possui enzimas análogas à quinase alvo dos compostos3. Esses inibidores de quinases também têm potencial de desempenhar atividade dual e proteger o miocárdio durante a infecção, já que relatos anteriores mostraram que a SRPIN340 evitou danos oxidativos em cardiomiócitos e músculo cardíaco de ratos4. Além disso, estresse oxidativo5 e a infecção pelo T. cruzi 6 levam à acumulação de matriz extracelular em fibroblastos cardíacos. Assim, o inibidor SRPIN340 e derivados também podem interferir no processo de fibrose cardíaca, condição incapacitante da fase crônica da doença de Chagas. Objetivos. Avaliar a atividade tripanocida de derivados de piperina, butenolídeos e SRPIN340; investigar se SRPIN340 e derivados protegem cardiomiócitos dos danos oxidativos causados pelo T. cruzi; analisar se SRPIN340 e derivados possuem atividade anti-fibrótica em fibroblastos cardíacos infectados pelo parasita. Metodologia. Triagem de atividade tripanocida – Formas tripomastigotas de T. cruzi Dm28c luc e células Vero infectadas pelo mesmo clone serão tratadas com derivados de piperina, butenolídeos e SRPIN340 por 24h e 72h, respectivamente, e a viabilidade dos parasitas avaliada pela adição de luciferina e leitura de luminescência7; Ensaios de washout- Culturas de vero infectadas com T. cruzi Dm28c luc serão tratadas com os compostos por 72h e depois os compostos serão removidos para avaliar a ressurgência de parasitas após 3 dias por detecção luminescente7; Análise de dano oxidativo-Culturas primárias de cardiomiócitos murinos serão infectadas e tratadas com SRPIN340 e derivados. A produção de espécies reativas de oxigênio será medida por reagente de Griess e através de microscopia de fluorescência com o corante MitoSOX Red (Invitrogen). Quantificação de colágeno- – Culturas de fibroblastos cardíacos murinos derivados de cultivo primário, infectadas pelo T. cruzi, serão tratadas com SRPIN340 e derivados. As culturas serão fixadas e coradas com corante Sirius Red/Fast Green por 2h, o que permite a medida semiquantitativa do conteúdo de colágeno e proteínas não colágenas em cultura8. Após lavagem, o corante é extraído das células com solução de NaOH 0,1 N /Metanol 1:1. As absorbâncias dos sobrenadantes resultantes serão lidas no leitor de microplacas Spectramax M2 (Molecular Devices) a ? 540 e 605 nm8; Referências Bibliográficas. 1. Franklim, T. N. et al. Molecules 18, 6366 (2013) 2. Conserva, G. A. A. et al. Phytomedicine 54, 302(2019) 3. Portal, D. et al. Molecular and Biochemical Parasitology 127, 9 (2003). 4. Huang, J. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 510, 97 (2019). 5. Philip, J. L. et al. Disease Models & Mechanisms 8, 1579 (2015). 6. Silva, T. A. et al. International Journal of Molecular Sciences 20, (2019). 7. Orlando, L. M. R. et al. Molecules 26, (2021). 8. Houghton, P. E. et al. Wound Repair and Regeneration 4, 489–495 (1996).

Bolsista: CHRISTIAN BASILIO OLIVEIRA
Orientador(a): Renata Gracie
Resumo: As mudanças climáticas já são uma certeza sem possibilidade de questionamento segundo relatórios do IPCC 2014 e 2021 e estas mudanças climáticas globais trazem impactos locais como por exemplo o aumento da ocorrência de chuvas concentradas em um curto período de tempo que favorece as inundações cada vez mais frequentes e provoca aumento das doenças como a Leptospirose e a Dengue. Por outro lado, a insuficiência de infraestrutura sanitária pode gerar uma situação de saúde bastante deficitária e resultar em aumento do número Doenças Relacionadas ao Saneamento Ambiental Inadequado – DRSAI, comprometendo a qualidade de vida das populações em países em desenvolvimento, como o Brasil. Tanto a dengue quanto à leptospirose são agravos que possuem sintomas e dinâmicas temporais bastante semelhantes. Por isso, acredita-se que haja uma confusão no diagnóstico dos casos, causando uma subnotificação da leptospirose uma vez que a dengue, sendo mais comum, é mais notificada. Em uma análise geográfica da ocorrência da leptospirose e da dengue, acredita-se que as desigualdades sociais, mudanças climáticas e a ação do homem são fatores muito importantes na determinação dessas doenças. Sendo assim, estudar estes dois agravos de maneira conjunta pode contribuir para a melhoria da vigilância desses agravos, contribuindo para a redução da ocorrência de casos, letalidade e das internações por ambos principalmente no contexto dos territórios periféricos do Rio de Janeiro Objetivo: analisar a correlação da ocorrência de leptospirose e dengue em territórios periféricos do Rio de Janeiro a partir das perspectivas socioeconômica, climática e de saneamento ambiental. Método: estudo de delineamento ecológico seccional baseados nos casos notificados de Leptospirose e de Dengue do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (Sinan) da Secretaria Municipal de Saúde do Rio de Janeiro-SMS RJ referente a população residentes em territórios Periféricos do município do Rio de Janeiro entre os anos de 2013 e 2023, bem como dados socioeconômicos proveniente do IBGE, dados ambientais e climáticos provenientes de fontes oficiais como o Alerta Rio da prefeitura do Rio de Janeiro. Para análise dos dados serão utilizados métodos estatísticos e de mineração de dados para cálculo dos indicadores brutos e ajustados. Além disso, serão calculados modelos de regressão para estabelecer correlação entre os desfechos em estudo e fatores socioeconômicos, climática e de saneamento ambiental. Resultados esperados: elaboração, consolidação e disponibilização de bancos de dados com as notificações compulsórias de Dengue e Leptospirose no Brasil dos últimos 10 anos disponíveis no SINAN e todos os registros de inundações provenientes de fontes oficiais como o Alerta Rio da prefeitura do Rio de Janeiro no mesmo período. Análises sobre a relação entre os desfechos Dengue e Leptospirose e eventos de inundação por fatores de risco socioeconômico e de saneamento. Relatório e artigo científico serão elaborados considerando mapas, gráficos e tabelas para contribuir com um plano de disseminação do conhecimento gerado a partir dos resultados.

Bolsista: MANUELA DE CASTRO GONCALVES
Orientador(a): MARIA LUCIANA SILVA DE FREITAS
Resumo: A imunopatogênese da leishmaniose visceral (LV) ativa é caracterizada por uma imunossupressão em paralelo a uma ativação imune sistêmica. Ambos os mecanismos podem contribuir para um comprometimento da resposta efetora específica ao parasito, impactando negativamente na evolução clínica dos pacientes. De fato, o status inflamatório exacerbado já foi associado à evolução para LV grave, onde altos níveis de citocinas inflamatórias precederam o óbito de pacientes com LV ativa, e se correlacionaram com parâmetros clínico-laboratoriais associados à gravidade. A literatura acerca dos fatores imunológicos que possam predizer tais desfechos é vasta. No entanto, as recidivas têm emergido como um desafio clínico adicional na LV e ainda pouco se investiga sobre os parâmetros imunológicos subjacentes. Nesse cenário, o grau de ativação de linfócitos T pode ser determinante para a senescência replicativa, que resulta no acúmulo de células T terminalmente diferenciadas, caracterizadas por uma deficiência na proliferação, produção de citocinas, e que podem ser identificados por marcadores fenotípicos. Assim, nossa hipótese é que o prejuízo imune da fase ativa da LV, ao lado das consequências do elevado grau de ativação, como a senescência replicativa, podem comprometer a qualidade da resposta efetora ao parasito e predispor às recidivas da LV. No contexto da coinfecção LV/HIV, nosso grupo verificou que pacientes com recidivas da LV (-R: recidivantes) mantiveram percentuais elevados de linfócitos T ativados ex vivo, diferente daqueles com primodiagnóstico da LV (-NR: não-recidivantes) que reverteram estes parâmetros a níveis próximos da normalidade. Além disso, os percentuais de células T senescentes foram elevados nos pacientes LV/HIV. Assim, acreditamos que, mesmo entre os não-coinfectados, a não-responsividade de clones específicos aos antígenos de Leishmania, em conjunto à morte celular induzida por ativação na periferia podem ajudar a explicar a perda do controle parasitário e a progressão para recidivas. Espera-se encontrar parâmetros imunológicos que possam ajudar a predizer esse prognóstico. Para confirmar tal hipótese, 30 pacientes com LV serão agrupados em -NR e -R, e acompanhados desde a fase ativa até 12 meses pós-tratamento. As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) serão obtidas por gradiente de centrifugação em Ficoll-Hypaque, criopreservadas e, posteriormente, descongeladas para estímulo in vitro frente aos antígenos de L. infantum. Após, parâmetros fenotípicos e funcionais em termos de senescência, ativação, proliferação e produção de citocinas intracelulares serão avaliados por citometria de fluxo multiparamétrica. Os resultados mais recentes são provenientes de experimentos de padronização da estimulação in vitro com os antígenos parasitários, seguido de imunofenotipagem extracelular e intracelular para a avaliação dos perfis fenotípicos propostos. Obteve-se sucesso na padronização, sobretudo, nas análises de proliferação celular pela marcação do BrdU, que foi confirmada pelo estímulo com mitógeno Concanavalina A. Finalmente, embora o n de pacientes seja pouco expressivo, a padronização foi efetiva em relação aos demais perfis avaliados, sendo possível estabelecer uma estratégia de análise bem definida.

Bolsista: LYS ALMEIDA E ALBUQUERQUE
Orientador(a): CINTIA XAVIER DE MELLO
Resumo: II - JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA A leishmaniose cutânea (LC) é uma doença infecciosa, causada por parasitos do gênero Leishmania. Segundo as recomendações da OMS e do Ministério da Saúde, o local de eleição para coleta de material para diagnóstico da LC, é a borda da lesão, pois supõe-se que essa localização contenha a maior quantidade de parasitos (OMS, 2010; BRASIL, 2017). Entretanto, a dispersão dos parasitos na lesão de LC tem sido rediscutida (RAMIREZ et al., 2000, ADAMS et al., 2014; SUAREZ et al., 2015). Nosso grupo tem estudado a distribuição parasitária na lesão, de Mello et al. (2011) avaliaram 110 pacientes empregando a escarificação de lesão cutânea ulcerada observando por microscopia ótica maior sensibilidade para o procedimento realizado na borda interna da lesão. Posteriormente, Thomaz et al. 2020 avaliaram essas mesmas amostras pela qPCR e confirmaram maior carga parasitária nesse local associada a maior necrose na análise histopatológica. Alguns aspectos ainda necessitam ser estudados mais profundamente com o auxilio de outras técnicas e incluindo todos os locais da lesão como o centro da úlcera. Esse trabalho tem como objetivo avaliar a carga e a viabilidade parasitária a partir de fragmentos de tecido obtidos de borda interna, externa e centro de lesões ulceradas de LC. Os resultados obtidos podem constituir evidências para novas diretrizes nacionais na conduta diagnóstica da LC. III - OBJETIVOS Objetivo geral Quantificar a carga parasitária utilizando a técnica de qPCR, e avaliar a viabilidade de Leishmania sp pela RT-qPCR em espécimes clínicos obtidos a partir de amostras coletadas de diferentes locais de lesões ulceradas de LC. Objetivos específicos a) Realizar revisão bibliográfica sobre a distribuição parasitária na lesão ulcerada de LC; b) Realizar a extração de DNA e RNA; c) Quantificar e comparar empregando a qPCR, a carga parasitária; d) Avaliar a viabilidade parasitária empregando a RT-qPCR através dos transcritos do gene 7SLRNA a partir de fragmentos de tecidos obtidos por biópsias da borda interna, externa e centro de lesões ulceradas suspeitas de LC; e) Avaliar e correlacionar os resultados com tempo de evolução de lesão e desfecho clínico; IV – METODOLOGIA Aspectos éticos e Delineamento do estudo Este estudo possui aprovação do CEP/IOC/FIOCRUZ (30323520.4.0000.5248) e se trata de uma análise transversal de um estudo de coorte. A população do estudo será constituída de pacientes que apresentarem lesões cutâneas ulceradas sugestivas de LC atendidos no período de 06/20 até 06/23 no INI/Fiocruz. Técnicas Laboratoriais A biópsia da lesão será realizada pelo médico e será retirado um punch de 3mm da borda interna, externa e centro da lesão sob anestesia local. Os fragmentos serão acondicionados em RNA later®. Para obtenção do RNA e DNA, será utilizado o método do Trizol associado a coluna RNeasy mini Kit. O RNA será quantificado pelo nanodrop® e, posteriormente, tratado com DNase I. A transcrição reversa será realizada a partir de 2,0 µg de RNA tratado, utilizando o Superscript IV Vilo®. A quantificação absoluta da carga parasitária (qPCR) nos sítios de lesão será realizada com base em diluições seriadas da curva padrão a partir de formas promastigotas de L. Braziliensis, utilizando primers direcionados ao kDNA (Weirather et al., 2011 ). E será realizada a quantificação do gen normalizador ?-actina humana (RODRIGUES et al, 2011). Para RT-qPCR, serão utilizados 100ng de cDNA por poço em triplicata. Será realizada uma quantificação relativa e os resultados serão expressos em 2-??Ct (fold change), entre amostras da borda interna, externa e centro. Serão utilizados iniciadores que amplificam a região do gen 7SLRNA de Leishmania (ZELAZNY et al., 2005), e iniciadores que amplificam o gene de referência GAPDH. Controles negativos e controles da reação de transcrição reversa serão adicionados a cada reação realizada. Todas as reações serão realizadas em triplicata utilizando o termociclador StepOne® sistema Sybrgreen.

Bolsista: ANDRE QUINTINO EVANGELISTA DUARTE
Orientador(a): SANDRA DE SOUZA HACON
Resumo: Título do Subprojeto: Alterações Climáticas e seus Impactos sobre as Doenças Transmitidas por Vetores O projeto tem por objetivo propor indicadores que permitam avaliar a associação entre mudanças climáticas e a incidência de doenças transmitidas por vetores no Brasil no período de 2000 a 2020 e por fim estimar a Carga Global das Doenças. Metodologia a) Oficinas com especialistas: As oficinas têm por objetivo discutir os indicadores socioeconômicos, ambientais e climáticos referentes à Leishmaniose. Essas continuarão a ser realizadas a fim de se obter informações específicas sobre cada bioma. b) Refinamento dos indicadores: O refinamento dos indicadores referentes à Leishmaniose estão em curso. Haverá ainda outras reuniões a fim de finalizar os indicadores já refinados. c) Sistematização de informações: Etapa já inicada que continuará em curso nos próximos meses. As informações incluídas nas planilhas serão as seguintes: dimensão do indicador, indicador temático, descrição curta, detalhamento/justificativa, fonte e relevância por bioma. d) Definição de indicadores: Serão definidos indicadores socioeconômicos, ambientais e climáticos das demais doenças a dos dados extraídos da revisão sistemática. Os indicadores referentes às demais doenças já foram definidos. e) Refinamento e finalização de indicadores: Os indicadores referentes às demais doenças serão estudados e trabalhados segundo a mesma metodologia. f) Inserção dos dados na plataforma AdaptaClima: Os indicadores propostos ao final do projeto serão inseridos na Plataforma AdaptaClima pela equipe do Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais (INPE) a partir do envio dos indicadores descritos e normalizados de acordo com a ameaça climática e com as doenças analisadas. g) Elaboração de artigos: A partir da definição dos indicadores de cada doença os artigos serão elaborados e submetidos a periódicos nacionais e/ou internacionais, de acordo com a definição a ser feita com a colaboração com todos os autores.