Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 3

Bolsista: ISABELE RODRIGUES PRAXEDES
Orientador(a): Yury Oliveira Chaves
Resumo: Com a nova era da terapia antirretroviral (TARV), as pessoas vivendo com HIV/AIDS (PVHA) estão atingindo a maior idade. No entanto, observa-se uma perda progressiva da integridade fisiológica, incluindo alterações osteoarticulares e diminuição da mineralização óssea, resultando em perda óssea. Este estudo buscou avaliar a saúde óssea de PVHA, descrever suas características, investigar perfis fenotípicos associados à perda óssea, quantificar os níveis séricos de RANK-L e OPG em PVHA e indivíduos HIV-negativos, analisar o perfil de citocinas inflamatórias e explorar a correlação entre os níveis de RANK-L/OPG e citocinas inflamatórias. Trata-se de um estudo observacional e transversal com 50 PVHA de ambos os sexos, acima de 40 anos. Após critérios de elegibilidade e assinatura do TCLE, os participantes realizaram densitometria óssea (DMO) e coleta de sangue para isolamento de PBMCs, imunofenotipagem de linfócitos TCD4+ e TCD8+ e dosagem de citocinas e OPG/RANK-L. Das 48 PVHA classificadas, 12 apresentavam densidade óssea normal, 23 osteopenia e 13 osteoporose, com predomínio do sexo masculino (28 homens e 20 mulheres). Os resultados mostraram que IFN-Gamma e IL-17A foram mais elevados em PVHA sem doença óssea, enquanto IL-2 aumentou nesses pacientes e em homens osteopênicos. IL-10 destacou-se no grupo sem doença óssea, e IL-6 esteve elevada em todos. OPG foi mais alto em mulheres osteopênicas e PVHA sem doença óssea, enquanto RANK-L reduziu em homens osteopênicos, aumentando a razão OPG/RANK-L. As análises de rede indicaram a influência imunológica na perda óssea, principalmente em homens osteopênicos. Além disso, o estudo caracterizou a disfunção regulatória de linfócitos TCD4+CTLA-4+ e TCD8+PD-1+ em homens PVHA. As análises séricas mostraram perfis imunológicos distintos, associando a resposta imune à remodelação óssea. O desbalanço na razão OPG/RANK-L pode estar relacionado à doença óssea em PVHA masculinos. As associações encontradas contribuem para a compreensão da perda óssea em PVHA e ressaltam diferenças imunológicas entre homens e mulheres com HIV, informações fundamentais para o manejo clínico desses pacientes.Palavras chaves: HIV, Osteopenia, Resposta imune, OPG, RANKL.

Bolsista: RYAN MARCELO SOEIRO DE OLIVEIRA
Orientador(a): Richard Hemmi Valente
Resumo: A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é endêmica na América Latina. Porém, a sua distribuição tem apresentado alcance global, atingindo milhões de pessoas no mundo. A ação direta do parasito, somada à resposta imune, afeta principalmente o tecido cardíaco e/ou o trato gastrointestinal, conjuntamente ao sistema nervoso. No entanto, as lesões teciduais comumente progridem de maneira subclínica, podendo o indivíduo infectado permanecer assintomático por décadas. Cerca de 30 a 40% dos casos evoluem para a fase crônica sintomática, período em que as drogas-padrão apresentam eficácia variável, de forma que outros medicamentos devem ser utilizados para o tratamento de sintomas específicos. Portanto, frente às características de evolução da doença, destaca-se a necessidade de biomarcadores capazes de indicar a progressão para a forma cardíaca ou digestiva, de modo a melhor assistir ao paciente através da oferta de formas alternativas de acompanhamento do quadro clínico, auxiliando na escolha do tratamento e, eventualmente, no prognóstico. Dado que a cardiopatia é a manifestação clínica mais severa e frequente, apresentando maior impacto socioeconômico, nosso grupo tem focado no estudo de proteínas de T. cruzi candidatas a biomarcadores da forma cardíaca da doença de Chagas. Recentemente, associamos a proteína CAP5.5 (imunorreativa) a pacientes cardiopatas em estágio B1. A fim de darmos continuidade aos estudos acerca dessa proteína, este subprojeto visa estabelecer uma metodologia de enovelamento in vitro para a CAP5.5 recombinante (CAP5.5r) purificada em condição desnaturante, almejando altos rendimento purificativo e grau de homogeneidade. Adicionalmente, a imunorreatividade da proteína recombinante com conformação obtida in vitro será avaliada para determinar sua possível aplicação como antígeno em ensaios de verificação de biomarcador por ELISA. Dessa forma, a expressão heteróloga da CAP5.5 foi inicialmente avaliada em Escherichia coli BL21(DE3) em diferentes condições de temperatura (20 e 37 °C) e concentração de indutor (0,062 a 1,000 mM de isopropil Beta-D-1-tiogalactopiranosídeo). De acordo com os resultados obtidos, a superexpressão da proteína recombinante não se mostrou um fator de toxicidade para a bactéria. Entretanto, houve um grande acúmulo de corpos de inclusão, provavelmente devido a uma taxa de síntese elevada. Consequentemente, independentemente da condição testada, observou-se mais de uma proteoforma de CAP5.5r, como resultado de diferenças no estado de enovelamento e, em maior grau, de degradação por endopeptidases. Novas transformações serão realizadas em cepas de E. coli comercialmente modificadas com pLysS, o qual expressa constitutivamente a T7 lisozima, proteína inibidora da RNA T7 polimerase. Uma vez que o método de expressão da proteína recombinante for estabelecido, a purificação será realizada por IMAC em condição desnaturante para posterior enovelamento in vitro. Por fim, em vista do interesse de aplicação da proteína recombinante como antígeno em ensaio de ELISA, a imunorreatividade das moléculas obtidas será avaliada por immunoblotting. O ensaio será realizado a partir de eletroforeses em condições nativas ou desnaturantes ou desnaturantes e redutoras de CAP5.5r, seguidas de western blotting e imunorevelação tendo IgG de pacientes por anticorpos primários do ensaio (IgG que foram utilizadas no estudo de prospecção que resultaram na identificação da CAP5.5 como candidata a biomarcador da forma cardíaca da doença de Chagas).

Bolsista: THIFANY FOSCHIERA DE MELO
Orientador(a): NIDIANE DANTAS REIS PRADO
Resumo: O ofidismo é uma Doença Tropical Negligenciada (DTN) de grande impacto no Brasil, principalmente na região Norte, onde Bothrops atrox é a principal responsável pelos acidentes ofídicos. Embora o tratamento com soros heterólogos seja eficaz na neutralização de efeitos sistêmicos, sua atuação sobre os danos locais ainda é limitada. Nesse contexto, os nanocorpos do tipo VHHs surgem como alternativa promissora, devido à sua alta especificidade, penetração tecidual e baixa imunogenicidade.No presente subprojeto, foram selecionados e caracterizados clones VHH com potencial neutralizante frente ao veneno de B. atrox. O clone BA15 foi isolado a partir de uma biblioteca construída especificamente contra o veneno de B. atrox, enquanto o clone BAc28 foi obtido a partir de uma biblioteca construída contra o veneno de Bothrops leucurus, sendo selecionado por panning cruzado. Ambos os clones demonstraram forte reatividade em ensaios de ELISA e foram expressos com sucesso em E. coli SHuffle(Marca Registrada) , com posterior purificação por cromatografia de afinidade. Nos ensaios de inibição da coagulação induzida pelo veneno de B. atrox, observou-se que, em concentrações individuais, os VHHs foram capazes de prolongar significativamente o tempo de coagulação plasmática. Notavelmente, a associação dos VHHs BA15 e BAc28, na proporção de 1:100 (60x BA15 e 40x BAc28 em relação à dose de veneno), foi capaz de inibir completamente a coagulação, evidenciando alta eficácia na neutralização da atividade coagulante do veneno. Diante desses resultados promissores, as próximas etapas do projeto preveem a expressão e caracterização de novos clones VHHs, bem como a condução de ensaios in vitro e in vivo utilizando formulações oligoclonais. Essas investigações visam validar a eficácia dos VHHs frente aos danos locais causados pelo veneno de B. atrox, consolidando seu potencial como alternativa terapêutica ao soro convencional e contribuindo para o desenvolvimento de estratégias inovadoras e mais eficazes no tratamento do ofidismo.

Bolsista: Nicolas Joaquim Guieiro de Carvalho
Orientador(a): Lileia Goncalves Diotaiuti
Resumo: A doença de Chagas (DC) causada pelo protozoário Trypanosoma. cruzi, permanece como uma doença de grande impacto médico social. A via vetorial é a principal forma de infecção do T. cruzi. Desse modo, o controle de triatomíneos por meio da aplicação de inseticidas tem fundamental importância do controle da DC. O uso excessivo e inadequado desses produtos acelera o processo da seleção de insetos resistentes. O fenômeno da resistência aos inseticidas pode ocorrer por diferentes mecanismos dentre eles, mutações genéticas, permitindo que alguns insetos sobrevivam à exposição de doses letais para a maioria dos indivíduos. No caso dos piretróides, já foram identificadas ao menos dez mutações no gene do canal de sódio associadas à resistência, conhecidas como knockdown resistance (Kdr). A detecção precoce da resistência é essencial para conter sua disseminação, além de tornar as ações de controle mais eficazes. Diante desse contexto, esse estudo teve por finalidade a caracterização de suscetibilidade à deltametrina e a análise da mutação de Kdr em triatomíneos. Espécimes de Triatoma sordida foram coletados nos municípios de Espinosa e Porteirinha, que apresentam perfil de infestação semelhante. Além dessas amostras, foi incluída uma população de P. megistus de Medeiros, município com alto número de registros de infestação recorrente por essa espécie. Os bioensaios, foram realizados utilizando deltametrina (99,6% de pureza) e acetona P.A., aplicando-se a dose diagnóstica (DD) estabelecida para triatomíneos. Em seguida, serão conduzidos bioensaios do tipo dose-resposta com ninfas de primeiro estádio. A avaliação da dinâmica da resistência em amostras de T. infestans previamente caracterizadas como resistentes, mantidas em insetário está sendo realizada por meio de testes quali-quantitativos. Para aprofundar o entendimento da resistência em T. infestans, será realizada a análise da mutação Kdr em insetos parentais coletados em campo e preservados a -20 °C, comparando com insetos mantidos em laboratório por várias gerações. O DNA foi extraído com o kit Wizard(Marca Registrada) e amplificado via Nested PCR, utilizando o método descrito por Capriotti et al. (2014). A padronização dos testes moleculares foi iniciada utilizando DNA extraído de pernas congeladas de T. infestans resistentes (Calahuta, Bolívia) e suscetíveis (Paulínia, SP). Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose, purificados e quantificados. O sequenciamento foi realizado parcialmente no Instituto René Rachou, e as sequências obtidas foram analisadas, alinhadas e comparadas a dados do NCBI. O teste qualitativo com T. infestans mostrou 76,6% e 100% de mortalidade expostos à dose diagnóstica (2,76 ng/µL), nas populações previamente caracterizadas como resistente e suscetível, respectivamente. As amostras dos insetos suscetíveis foram analisadas. A substituição de Timina (T) por Citosina (C), associada à resistência não foi observada. Apesar das amostras de T. infestans resistentes apresentarem fragmentos do tamanho esperado (500 pb), o sequenciamento ainda não foi concluído. O número amostral de insetos coletados no campo é essencial para constituição de colônias com número suficiente de ninfas que viabilizem os testes de suscetibilidade. Essa é uma dificuldade frequente, refletindo a complexidade dos estudos de suscetibilidade dos inseticidas aos triatomíneos, visto que os estudos necessitam de um grande número amostral. Na análise do Kdr, observou-se que as espécies de T. infestans, consideradas suscetíveis, apresentam indícios de suscetibilidade, uma vez que não foi constatada a mutação Kdr. Acredita-se que os resultados obtidos nesse estudo possam contribuir na avaliação e melhoria das atividades desenvolvidas junto ao controle químico dos triatomíneos.

Bolsista: VITORIA FONSECA GOMES
Orientador(a): Andre Luiz Franco Sampaio
Resumo: O desenvolvimento de fármacos e medicamentos passa por uma etapa vital de decisão de via de administração, onde a via preferida para administração é a via oral, devido à melhor adesão dos pacientes à terapia. Para tal, é necessário definir a capacidade de novas moléculas de ultrapassarem a barreira gastrointestinal e serem absorvidas. Os modelos in vitro surgem como uma alternativa mais barata e rápida de observar a permeabilidade de candidatos a fármacos em barreiras biológicas humanas. Estes métodos alternativos possuem a capacidade de predizer de forma próxima a um sistema in vivo, e guiar o desenvolvimento dos potenciais fármacos. A linhagem Caco-2, é utilizada em modelos in vitro para mimetizar a barreira gastrointestinal, responsável pela absorção de moléculas por via oral. Em cultura, essas células se diferenciam espontaneamente e se assemelham aos enterócitos em relação à morfologia e funcionalidade. Além de utilizar o modelo de permeabilidade em Caco-2 para prever a absorção oral de substâncias, também é possível realizar outros ensaios para predizer a toxicidade intestinal, possibilitando previsão de possíveis danos e alterações na própria barreira gastrointestinal. Dentre as vias de administração a via orla é a que traz maior facilidade de administração de forma que os medicamentos de administração oral tem sucesso na adesão do esquema terapêutico por pacientes. Os aurelianolídeos A e B são substâncias descritas recentemente e resultados recentes do nosso grupo mostram que estas moléculas apresentam bom potencial antitumoral. Avaliar os aurelianolídeos no modelo gastrointestinal pode auxiliar no desenvolvimento destas substâncias como novos fármacos antitumorais, avaliando a possibilidade do desenvolvimento de um medicamento por via oral. O protocolo de diferenciação da célula Caco-2foi baseado no protocolo n°142 do banco de métodos alternativos do Centro Europeu de Validação de Métodos Alternativos. As células Caco-2 foram semeadas em placas de 12 poços com insertos permeáveis, com poros de 0,4microm, com 0,33 x 10 células/poço em 500microL na região apical, e 1500microL de meio de cultura na região basolateral. Após crescimento, a diferenciação das células, em torno do dia 21, foi verificada através da resistência transepitelial (TEER), identificando a formação da barreira gastrointestinal aos poços que apresentaram diferença maior que 150Ômega/cm². Também foram realizados testes de permeabilidade com Amarelo de Lúcifer e Doxorrubicina, substâncias conhecidas por não atravessarem a monocamada de células Caco-2. Foram realizados testes de integridade da barreira após os tratamentos com os aurelianolídeos. Foi possível observar leve aumento da resistência das barreiras após 1 hora e queda após 2 horas nos poços tratados com Amarelo de Lúcifer e aurelianolídeo A. Enquanto os poços tratados com aurelianolídeo B sofreram maior queda na resistência ao longo do tempo. Apesar desta queda, a resistência aferida nos poços tratados com o aurelianolídeo B, em duas horas, ainda estava acima dos valores de resistência que indicam a integridade da monocamada de células (> 160 Ômega).. Os ensaios de permeabilidade foram realizados com os aurelianolídeos A e B, com as coletas das amostras apicais e basolaterais nos tempos de 30 minutos, 1 hora e 2 horas, sendo acondicionadas em freezer para preservação. A análise das concentrações das substâncias nas amostras será conduzida pelo Dr. Filipe Quirino do Laboratório de Farmacocinética não Clínica. Portanto, neste trabalho foi possível dar início ao estabelecimento do modelo de permeabilidade de fármacos com a linhagem Caco-2, verificando a integridade da barreira pela aferência da resistência transepitelial (TEER) e pelo teste de permeabilidade utilizando o Amarelo de Lúcifer como controle negativo. Além disso, iniciaram-se testes com os aurelianolídeos A e B, candidatos a fármacos, verificando sua permeabilidade e citotoxicidade para avaliação dessas moléculas como possíveis medicamentos orais.

Bolsista: PAULO GABRIEL CASTELANO DE ALMEIDA
Orientador(a): RENATO PORROZZI DE ALMEIDA
Resumo: A Leishmaniose visceral é uma doença parasitária causada, no Brasil, por protozoários da espécie Leishmania infantum. O aumento de casos de Leishmaniose visceral é de extrema preocupação para autoridades de saúde, uma vez que se trata de uma doença de elevada letalidade se não tratada. Atualmente, considera-se como fatores preocupantes a não disponibilidade de vacinas para a prevenção da doença humana e o fato de que os fármacos disponíveis para o tratamento possuem elevada toxicidade. Há uma carência de fármacos novos e eficazes no controle do parasito e que apresentem menor toxicidade e efeitos adversos. Além disso, há diversas evidências de resistência do parasito aos fármacos atuais, tornando premente a busca por novas formas de tratamento. Estudos prévios têm mostrado que a via intracelular da MAPK (mitogen-activated protein kinase) possui relevância para a sobrevivência, proliferação e diferenciação das diversas formas da Leishmania sp. no hospedeiro mamífero. Além disso, o processo inflamatório modulado pela via da MAPK em células hospedeiras durante a infecção parece ter relevância significativa para a patogenia da leishmaniose visceral. A MAP4K4 é uma isoforma da via das MAPK e seu envolvimento em outras doenças de curso inflamatório têm sido descrito. Assim, este estudo tem como objetivo avaliar o efeito in vitro da droga PF-6260933, inibidora da MAP4K4, sobre culturas de promastigotas e amastigotas intracelulares de Leishmania infantum e seu papel imunomodulador sobre linhagens de macrófagos humanos e caninos. A cepa IOCL3598 isolada de cão doméstico em Barra Mansa-RJ foi selecionada para o estudo. Foi realizada a curva de crescimento de promastigotas que revelou a fase logarítmica de crescimento entre 24 e 72h de cultivo. Utilizando promastigotas deste ponto da curva, realizou-se um experimento sobre o efeito do inibidor PF-6260933 no crescimento de promastigotas por 24h nas concentrações de 0µM ; 1µM ; 2µM ; 3µM ; 4µM ; 5µM ; 10µM ; 20µM ; 45µM ; 67µM e 100µM. O marcador de viabilidade Zombie acqua foi utilizado nesta etapa e as quantificações realizadas por citometria de fluxo. Como resultado, identificou-se a IC50 entre 4 e 5 ug/mL do inibidor. A infecção de macrófagos DH82 com a mesma cepa de L. infantum e na presença de 1, 3 e 5ug/mL de inibidor mostrou que em amastigotas intracelulares, 5ug/mL foi capaz de inibir o índice de infecção em 34,5%. O estudo segue em andamento, com perspectiva de repetição dos ensaios para compor as réplicas, assim como a análise do sobrenadante das culturas de macrófagos nos ensaios de inibição. Serão avaliados os efeitos do inibidor na proliferação e na morte das promastigotas por citometria de fluxo, no índice de infecção de macrófagos e na redução da síntese de fatores inflamatórios pelos macrófagos infectados, os quais estão envolvidos no dano tecidual e progressão da doença. Assim, acreditamos que este fármaco possa apresentar um efeito benéfico duplo interferindo com a replicação dos parasitas e reduzindo a resposta inflamatória prejudicial.