Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 2

Bolsista: GIOVANNA COSTA DA SILVA
Orientador(a): LEONARDO PAIVA FARIAS
Resumo: Caracterização do problema - A infecção pelo HTLV-1 afeta cerca de 5 a 10 milhões de pessoas, de acordo com a última estimativa global baseada apenas em dados epidemiológicos de áreas endêmicas. A escassez de dados confiáveis de várias áreas densamente povoadas, que ainda têm a prevalência do HTLV-1 mal definida ou indeterminada, subestima o número global de pessoas infectadas pelo HTLV-1. A infecção pelo HTLV-1 não necessariamente implica no surgimento de doenças em seus portadores. Embora a maioria das pessoas infectadas permaneça assintomática, elas se tornam reservatórios virais e continuam a cadeia de transmissão. Fatores envolvidos na interação entre o vírus e o hospedeiro, como a via de transmissão, o número de exposições, a infectividade viral e a susceptibilidade genética e imunológica do hospedeiro, estão relacionados aos diferentes desfechos clínicos da infecção pelo HTLV-1. Cerca de 4 % dos indivíduos infectados podem desenvolver a ATLL, um câncer raro das células T do sistema imunológico. As formas mais agressivas da ATLL, aguda e linfomatosa, possuem um dos piores prognósticos dos linfomas não Hodgkin. Estado atual do conhecimento - Tratamentos quimioterápicos e/ou o uso de anticorpo monoclonal não estendem a sobrevida mediana além de 1-2 anos. Eles têm por finalidade obter resposta completa ou parcial e progredir para o transplante de medula óssea, que prolonga a remissão. O mecanismo de infecção do HTLV-1 ocorre através da integração do material genético do vírus no genoma da célula hospedeira. Desse modo, o ideal é buscar uma terapia que consiga remover o vírus das células infectadas, evitando as manifestações clínicas e a cadeia de transmissão. A padronização de um sistema de edição pela técnica de CRISPR-Cas9, em nosso grupo de pesquisa, abriu perspectiva para expandir o número de alvos e adaptá-lo para um sistema multiplex de edição simultânea com utilização de múltiplos guias para múltiplos alvos. O estado da arte sobre a aplicação da terapia gênica baseada em CRISPR-Cas para infecções virais demonstra que a introdução de hipermutações, inserções e deleções (indels), em alvos virais altamente conservados pode desencadear a inativação do vírus e,quando em sinergia com a excisão, pode prevenir a evasão viral. Objetivos - Dessa forma, este subprojeto tem como objetivo o desenvolvimento e a utilização de um sistema multiplex de edição, que além de remover o genoma proviral do HTLV-1, da linhagem celular da ATLL, MT2, possa impedir o escape viral e seus efeitos indutores proliferativos. Metodologia - RNAs guias tendo como alvo as regiões gênicas HBZ e Tax serão desenhados e clonados para a montagem Golden Gate de um sistema multiplex de gRNAs agindo de forma sinérgica com os RNAs guia que têm como alvo as LTRs. A análise da eficiência (capacidade infectante e a quantificação da carga proviral das células editadas) da edição simultânea das LTRs, HBZ e Tax pelo sistema multiplex, será realizada e comparada com a eficiência da edição das LTRs, pelo sistema já estabelecido no laboratório. Perspectivas do projeto - Espera-se que o sistema multiplex de edição, além de excisar o genoma proviral também impeça o escape viral e seus efeitos indutores proliferativos. Além disso espera-se que os resultados desse subprojeto possam contribuir para traduzir novos conhecimentos e abordagens em estratégias terapêuticas para a ATLL.

Bolsista: ANA BEATRIZ LAMEGO VIANA
Orientador(a): Tânia Salgado Pimenta
Resumo: Esse subprojeto está relacionado ao projeto “Enfermidades atlânticas: migrações, interseccionalidades e história digital: Doenças, gênero, mortalidade e trabalho em Cidades Negras (Luanda, Rio de Janeiro, Havana, Salvador, Recife, São Luís e Porto Alegre, c. 1790-1920)”. Para desenvolvermos o presente subprojeto, faremos o levantamento dos anúncios de barbeiros-sangradores publicados no Almanak Laemmert de 1844 (1º ano do periódico) até 1888 (ano da abolição da escravidão) e dos anúncios de barbeiros-sangradores publicados no Jornal do Commercio no mesmo período (estabelecendo uma amostragem), a fim de confeccionar mapas interativos para desenvolver uma análise espacial sobre esse ofício. Pretendemos investigar os barbeiros-sangradores, que exerciam uma das artes de curar mais difundidas no Brasil no século XIX. A sangria era uma das práticas terapêuticas mais utilizadas por diversos grupos sociais. Devido a seu caráter mecânico e proximidade com o sangue, esta atividade era relegada aos grupos mais subalternos, identificados como escravos e forros no contexto estudado. Os barbeiros-sangradores não se limitavam a sangrar, sendo muitas vezes dentistas, além de oferecerem corte de barba e cabelo e atuarem como músicos (PIMENTA, 1998). Nesse sentido, consideramos relevante procurar identificar os anúncios de sangradores no período posterior à pesquisa de minha orientadora (1808-1828), a fim de avaliar a oferta de seus serviços e avançar no sentido de investigar possíveis diferenças entre os perfis de quem anunciava em dois periódicos com características bem distintas, Almanak Laemmert e Jornal do Commercio. Com os dados organizados, a análise espacial contribuirá para um mapeamento mais completo e para estabelecer possíveis diferenças nos perfis dos anunciantes de cada periódico. O objetivo geral é Analisar espacialmente as semelhanças e diferenças entre os anúncios dos dois periódicos ao longo do tempo (1844 a 1888) e os objetivos específicos são: Identificar a oferta do serviço de barbeiro-sangrador quantitativamente na cidade do Rio de Janeiro (1844 a 1888); Realizar o mapeamento da oferta do serviço de barbeiro-sangrador na cidade do Rio de Janeiro (1844 a 1888); Realizar um estudo do perfil dos barbeiros-sangradores a partir dos dados coletados e do mapa confeccionado, identificando outras atividades nos anúncios, como “tirar dentes” e analisar a distribuição espacial desses serviços na cidade do Rio de Janeiro (1844 a 1888). Pretende-se realizar uma ampla investigação empírica sobre os anúncios dos serviços de barbeiros-sangradores na cidade do Rio de Janeiro com a pesquisa realizada nos periódicos Almanak Laemmert e Jornal do Commercio, ambos disponíveis online, no período entre 1844 e 1888. O levantamento de dados no Almanak Laemmert, que é anual, encontra-se avançado, na década de 1870 e o levantamento no Jornal Commercio será feito por amostragem a ser definida com minha orientadora, já que se trata de um jornal diário. A sistematização dos dados será feita em planilha do excel e o mapeamento será feito com programa de georreferenciamento, para o qual completei três cursos.

Bolsista: BRUNO VINAGRE RIBEIRO
Orientador(a): Natalia Machado Tavares
Resumo: O diabetes é uma doença metabólica que apresenta altos níveis de glicose circulantes e está associada a diversas complicações secundárias micro e macrovasculares. As células imunes, especialmente os macrófagos, têm um papel importante na regulação da resposta imune e o desbalanço do perfil M1/M2 é um quadro característico na doença, com estímulo de produção de citocinas pró-inflamatórias, que caracterizam a inflamação sistêmica. Além disso, a disfunção mitocondrial é um fator que contribui para o desenvolvimento e imunopatogênese do diabetes, pois promove a produção de espécies reativas de oxigênio e indução do fenótipo M1 em macrófagos humanos. O dano celular causado pela hiperglicemia crônica também leva à liberação de produtos mitocondriais que ativam receptores relacionados com a resposta imune. O projeto tem como objetivo compreender a disfunção mitocondrial em células imunes de pacientes diabéticos, relacionando com o desenvolvimento da doença.

Bolsista: MARIA GABRIELA FERREIRA DA SILVA
Orientador(a): REGINA CELIA BRESSAN QUEIROZ DE FIGUEIREDO
Resumo: As Leishmanioses causadas por protozoários pertencentes ao gênero Leishmania são doenças negligenciadas graves que podem se manifestar clinicamente sobre a forma cutânea, mucocutânea e visceral. Enquanto as formas tegumentares podem levar a segregação e estigma social por causa da severidade das lesões, a forma visceral pode ser fatal se não tratada adequadamente. Independentemente da forma clínica, o tratamento das leishmanioses ainda se baseia no uso de antimoniatos pentavalentes, Anfotericina B e Mitefosine, os quais possuem sérios efeitos colaterais, e necessitam quase sempre de acompanhamento médico intensivo, o que podem levar ao abandono do tratamento e ao aparecimento de cepas resistentes. Estas limitações apontam para necessidade de novos alternativas terapêuticas para combater os efeitos devastadores das leishmanioses nas populações afetadas. Sabe-se que o sucesso da infecção das células hospedeiras por parasitos intracelulares depende, entre outros fatores, da forma como o parasita reconhece e explora organelas e vias metabólicas dos hospedeiros estabelecendo um ambiente que forneça os nutrientes para o seu desenvolvimento, proteção contra a resposta imune, enquanto garantem o suporte para a sua disseminação no organismo. Dentre as organelas mais exploradas por patógenos, o Retículo Endoplasmático (RE) se destaca pelo seu papel na síntese, dobramento, modificação e transporte de proteínas. Um desequilíbrio da sua fisiologia, induzida por fatores tais como a infecção por patógenos intracelulares, pode levar ao acúmulo de proteínas mal dobradas resultando na perturbação da homeostase desta organela, referida com estresse do RE. Na tentativa de restabelecer a sua função e diminuir o estresse, o RE lança mão de respostas adaptativas como a UPR (unfolded protein response), a qual é essencial para restabelecer a homeostase da organela. Diante da hipótese de que a associação de Leishmania spp com organelas intracelulares dos hospedeiros pode determinar o sucesso ou não da infecção, bem como o destino das células hospedeira, estratégias que inibam a UPR, podem ser um caminho terapêutico para tratamento das leishmanioses. O ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) é um ácido biliar hidrofílico, muito utilizado na medicina tradicional chinesa para diferentes propósitos tais como: tratamento de cirrose biliar, doenças do fígado, coração e bexiga e várias outras de origem inflamatória e infeciosas. O mecanismo por trás de seus efeitos mostra que TUDCA é um potente inibidor do estresse do RE, prevenindo as consequências prejudiciais da UPR quando o estresse do RE se torna persistente. Apesar do seu potencial citoprotetor em vários modelos, nos quais o dano e morte celular resulta de um estresse persistente do RE, o estudo deste inibidor sobre o estresse do retículo induzido por Leishmania spp em células de mamífero ainda não foi investigado. Assim, no presente trabalho, nós investigaremos a interação de Leishmania com diferentes organelas, com ênfase no retículo endoplasmático, durante o curso da infecção pelo parasito em macrófagos de linhagem. Esperamos com nossos resultados contribuir para descoberta de novas terapias que inibam os efeitos colaterais adversos da UPR em células infectadas por Leishmania spp. Durante a execução deste projeto também buscaremos introduzir novas abordagens experimentais in sílico e in vitro que permitam otimizar nossos protocolos para análise dos efeitos de potenciais inibidores do RE no modelo de infecção por Leishmania spp.

Bolsista: BEATRIZ CARDOSO PESSANHA
Orientador(a): CRISTINA HENRIQUES
Resumo: A doença de Chagas é considerada negligenciada, e o benznidazol é a única droga usada no tratamento, causa sérios efeitos colaterais e possui baixa eficácia. Na busca de novos compostos e esquemas terapêuticos são necessários vários testes in vitro e in vivo, entretanto, é fundamental que sejam desenvolvidos métodos rápidos e reprodutíveis de avaliação de compostos, reduzindo os viéses metodológicos relacionados com a contagem de células. Com esse objetivo produzimos cepas de T. cruzi Dm28 geneticamente modificadas (GM), expressando a enzima luciferase (Dm28-Luc) e a proteína fluorescente EGFP (Dm28-EGFP), ferramentas importantes para padronização de novos métodos de análise utilizando novas tecnologias. Primeiramente foram realizados ensaios de padronização do modelo, em linhagem de células LLC-MK2 infectadas com T. cruzi cepa Dm28 GM, para os testes in vitro. Foram determinadas, a quantidade ideal de células LLC-MK2, e as condições de cultivo. As cepas Dm28-Luc, Dm28-EGFP, foram capazes de infectar as células LLC-MK2 e de manter a infecção com o aumento do número médio de amastigotas intracelulares ao longo do tempo, em comparação com a cepa selvagem (Dm28-WT). Utilizando o posaconazol como curva padrão das avaliações dose-resposta, o IC50 para as amastigotas intracelulares em células LLC-MK2 infectadas com T. cruzi cepa Dm28-WT, foi estimado em 1,25 nM por contagem em microscópio óptico e cálculo do índice de infecção. Curvas dose-resposta com posaconazol em leitor de microplaca (luminômetro/flourímetro) para estimar o IC50 em amastigotas intracelulares de LLC-MK2 infectadas com T. cruzi GM (Dm28-Luc, Dm28-EGFP) produziram valores de IC50 próximos dos valores estimados por contagem, 1,9 e 1,5 nM para amastigotas de Dm28-Luc e para Dm28-EGFP, respectivamente. Amastigotas da cepa Dm28-EGFP em células LLC-MK2 podem ser de grande auxílio na triagem de compostos pelo leitor de microplaca, assim como para avaliações automatizadas pelo sistema de análise de alto conteúdo (HCS), permitindo o cálculo do índice de infecção e do IC50. As imagens das células e protozoários fluorescentes adquiridas com os filtros FITC, DAPI e Cy3 pela plataforma automatizada de microscópia de fluorescência ImageXpress Micro confocal, e em seguida análisadas de forma automatizada em pipeline customizado pelo software CellProfiler. Pelo método automatizado, em amastigotas de células LLC-MK2 infectadas com Dm28-EGFP o IC50 para posaconazol foi estimado em 1,84 nM, semelhante ao encontrado anteriormente pelos outros métodos. Portanto, as metodologias de avaliação de compostos em amastigotas intracelulares de LLC-MK2 infectadas com T. cruzi GM, pelo leitor de microplaca e pelo sistema automatizado HCS, se mostraram apropriadas. O nosso objetivo é de avaliar a atividade de extratos de plantas Piper amalago e Piper glabratum pelo sistema de análise de alto conteúdo (HCS) e leitor de microplaca, utilizando as cepas de T. cruzi geneticamente modificadas, Dm28-EGFP e Dm28-Luc.

Bolsista: THIFANY FOSCHIERA DE MELO
Orientador(a): NIDIANE DANTAS REIS PRADO
Resumo: Introdução: Atualmente o tratamento do ofidismo se restringe aos soroterápicos obtidos predominantemente pela hiperimunização de equinos, estes soroterápicos apresentam elevada eficácia para neutralização dos danos sistêmicos, porém é menos eficaz quanto à neutralização dos danos locais, que são agravos importantes em envenenamento por serpentes do gênero Bothrops, gênero responsável pela maior parte dos acidentes ofídicos no Brasil, com maior média de ocorrência registrada na região Norte do país, sendo a espécie Bothrops atrox responsável pela maioria dos casos de envenenamento na região. Diante dos desafios inerentes a soroterapia antiofídica, e dentre as ferramentas biotecnológicas disponíveis pode-se destacar o potencial dos anticorpos tipo VHHs, que apresentam elevado potencial de reconhecimento antigênico, alto índice de penetração tecidual, alta solubilidade e estabilidade para variações de temperatura e pH. Assim, a obtenção de um amplo repertório de VHHs é de grande importância no que tange a alternativas terapêuticas ao ofidismo, disponibilizando VHHs para preparações oligoclonais com grande potencial de neutralização dos danos locais ocasionados pelo envenenamento. Objetivo: O projeto visa a seleção e caracterização de VHHs quanto ao potencial de neutralização das atividades citotóxicas promovidas pelo veneno de serpentes do gênero Bothrops. Material e método: Para seleção dos VHHs foi realizada análise das sequências de códons referentes à VHHs, com posterior realização de subclonagem que viabiliza a expressão dos VHHs, com a renovação do projeto será realizada a expressão dos VHHs em sistema procarioto, seguido de purificação por cromatografia de afinidade. Após purificação a imunoafinidade será analisada por ensaio imunoenzimático. Avaliar a capacidade de neutralização de citotoxicidade in vitro através da dosagem de LDH em miotubos, além de avaliar a neutralização em ensaios in vivo com a administração de veneno e toxinas do gênero Bothrops administradas por via intramuscular seguido de tratamento com VHH, com posterior dosagem de CK e LDH dos animais. Resultados e discussão: Após análise do sequenciamento foram obtidos 2 clones distintos, que foram posteriormente subclonados em vetor pET22b(+) com o intuito de otimizar a expressão dos VHHs, bem como a purificação por cromatografia de afinidade. Conclusão: Dado o andamento dos experimentos realizados, conclui-se que referido projeto mostra-se promissor para a vertente de inovação terapêutica ao ofidismo, visto que a recombinação gênica mostrou resultados satisfatórios viabilizando a expressão em sistema bacteriano para posterior realização de testes de afinidade e neutralização, além da seleção de novos clones com ampliação da biblioteca, que correspondem aos desdobramentos do projeto em andamento. Palavras-chave: VHH; Ofidismo; Nanocorpo.