Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 1

Bolsista: Rodrigo Bezerra da Silva
Orientador(a): ADRIANA SOTERO MARTINS
Resumo: JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA Atualmente, no Brasil e no Mundo, observam-se vários exemplos da utilização de água de reúso na agricultura (MANCUSO e SANTOS, 2013). A água de reúso é definida como a reutilização de águas, estas provenientes de efluentes tratados (MORAIS et al., 2016). A agricultura é a atividade econômica que mais demanda água, e devido à escassez das fontes hídricas para esta atividade em diversas regiões, a água de reúso se torna uma alternativa para enfrentamento desse problema (MANCUSO e SANTOS, 2013). A utilização de água de reúso traz diversos benefícios à agricultura como fonte de nutrientes que auxiliam o crescimento de cultivos e de água, entretanto deve-se ter segurança da qualidade sanitária para não prejudicar a saúde humana e ambiental. A água de reúso pode conter micropoluentes, tais como produtos químicos e microrganismos, podendo oferecer riscos à saúde pública e ambiental. A utilização da água de reúso na microbiota do solo podem ou não beneficiar microrganismos, variando de acordo com a quantidade aplicada e composição da água de reúso. Quando aplicada em alta quantidade e possuir uma grande carga de nutrientes como fósforo e nitrogênio, patógenos, metais pesados e antibióticos, o solo não consegue realizar a sua função de reciclabilidade, e assim pode alterar as características do solo (LIU et al., 2013). OBJETIVOS Objetivo Geral Analisar alterações na microbiota do solo antes e após os ensaios de irrigação com água de reúso dos cultivos de hortaliças Petroselium sativum. Objetivos Específicos Avaliar alterações na microbiota do solo antes e depois dos ensaios de rega de hortaliças Petroselinum sativum (salsa) com água de reúso Analisar a presença de bioindicadores moleculares de contaminação na água de reúso e indiretamente avaliar os efeitos desse tipo de água sobre a microbiota do solo. METODOLOGIA Para avaliar alterações na microbiota do solo antes e depois dos ensaios de irrigação de hortaliças Petroselinum sativum com água de reúso, serão realizados ensaios utilizando a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), usando bioindicadores moleculares de contaminação. Serão utilizados iniciadores (primers) específicos de microrganismos associados à contaminação hídrica por esgoto doméstico (MOURA, 2019), tais como: Escherichia coli (E. coli), Adenovírus sorotipos 40 e 41, e Methanobrevibacter smithii (M. smithii). Estes microrganismos serão usados, pois foram verificados como presentes em estudo de Moura (2019), que foram as mesmas amostras de água de reúso utilizadas no presente estudo. A PCR será realizada com volume de 3 MicroLitro (20 ng) de DNA, utilizando um termociclador VERITI Applied Biosystems. Para que seja feita a PCR dos três microrganismos alvos ao mesmo tempo o protocolo de Moura (2019) será otimizado, para que as etapas de ciclagem da máquina corram simultaneamente. Após a PCR, 10 Microlitro das reações serão submetidas à eletroforese, e depois serão feitas as visualizações das bandas de amplificação nos géis, por meio de exposição à luz ultravioleta (UV). A atividade de acesso ao Patrimônio Genético foi cadastrada no SisGen sob o n AAC8F2F, em atendimento ao previsto na Lei n 13.123 2015.

Bolsista: ALMERIO LIBORIO LOPES DE NORONHA FILHO
Orientador(a): Lucas Pedreira de Carvalho
Resumo: A Leishmaniose é uma doença parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. Estes parasitos infectam e sobrevivem principalmente nos macrófagos, porém outros tipos de células tais como as células dendriticas, linfócitos e neutrófilos participam na patogênese desta doença. A leishmaniose tegumentar americana (LTA) causada por Leishmania braziliensis pode causar desde a leishmaniose cutânea (LC), associada a uma ou mais úlceras granulomatosas, até as debilitantes formas disseminada (LD) ou mucosa (LM) da doença (Marsden et al., 1985; Schriefer et al., 2009; Carvalho et al., 2012). A resposta imune na LC é caracterizada por uma forte resposta inflamatória, tipicamente Th1. Linfócitos de pacientes com LC produzem IFN-y que é a mais importante citocina ativadora de macrófagos, e com isso impedem a multiplicação e a disseminação de parasitos (Ameen M., 2010). Todavia, a L. braziliensis persiste nas células infectadas e leva a grande produção de citocinas pro inflamatórias como IL1? e TNF que estão associadas à gravidade da doença ( Bottrel et al., 2001 ; Bacellar et al., 2002; Follador et al. , 2002 ; Vargas et al. , 2010 ; Carvalho et al., 2012; Santos D et al., 2018). Mais recentemente, tem sido destacado o papel de macrófagos na resposta inflamatória desde que essas células são predominantemente responsáveis pela produção de TNF e IL-1? (Santos, D et al., 2018). Além disso, células NK e T CD8+ produtoras de granzima B e perforina infiltram a lesão de pacientes com LC e induzem resposta inflamatória contribuindo para o desenvolvimento da úlcera cutânea (Novais, F et al. 2018; Santos, D et al., 2018) Corte de Pedra é um distrito do município de Presidente Tancredo Neves no sudeste do estado da Bahia. Está é uma área de transmissão de L. braziliensis onde cerca de 1000 casos da doença são acompanhados por ano. Cerca de 5% dos pacientes com LC desta área endêmica apresentam teste cutâneo negativo (DTH-) para antígenos de Leishmania. Estes são indivíduos com teste negativo para HIV e sem qualquer outra doença. Nossos dados preliminares mostram que pacientes com DTH- falham mais a terapêutica com antimonial pentavalente, e células mononucleares do sangue periférico produzem menos IFN-gama em resposta à antígenos de Leishmania quando comparados a pacientes com DTH+. A nossa principal hipótese é que pacientes DTH- falhem a terapêutica devido a uma baixa resposta Th1 local, e que a alta carga parasitária leve a uma resposta inflamatória exacerbada, contribuindo para o dano tecidual.

Bolsista: YURI MATEUS GARCIA DA SILVA
Orientador(a): Maria Helena Neves Lobo Silva Filha
Resumo: 1. Justificativa e relevância. Biolarvicidas à base do Lysinibacillus sphaericus têm sido utilizados com sucesso para o controle de culicídeos, e o principal fator inseticida é a protoxina, denominada Binária (Bin). A resistência de C. quinquefasciatus à toxina Bin já foi registrada e, na maioria dos casos, ela está associada à ausência do receptor Cqm1 no microvilli intestinal, pois a ligação toxina Bin-receptor é uma condição sine qua non para a ação do L. sphaericus. O nosso grupo de pesquisa selecionou, em laboratório, colônias de C. quinquefasciatus com alto nível de resistência à toxina Bin que têm servido como um modelo para a caracterização. Uma das colônias estudadas, R2362-A1, é formada por indivíduos homozigotos para um alelo do gene cqm1 (cqm1REC) cuja mutação impede a expressão de receptores Cqm1 no epitélio intestinal, e confere alta resistência à toxina Bin. Um estudo do transcriptoma de intestinos de larvas da colônia resistente revelou que o gene que codifica a enzima panteteinase (CPIJ017593) teve um nível de repressão mais acentuado do que o próprio receptor Cqm1. A nossa hipótese é que esta molécula desempenha um importante papel na ação da toxina Bin e esta é uma investigação inédita visto que não há qualquer descrição ou caracterizaçao desta proteína em insetos. 2. Objetivos. Este estudo visa avaliar o perfil de transcrição da panteteinase em larvas de C. quinquefasciatus suscetíveis (S) e resistentes (R) ao biolarvicida L. sphaericus e contribuir para a caracterização desta molécula. Os objetivos específicos são: a) quantificar e comparar os níveis de transcrição gênica entre amostras de larvas resistentes e suscetíveis por transcrição em tempo real. b) quantificar e comparar os níveis de transcrição gênica entre amostras de adultos (machos e fêmeas) resistentes e suscetíveis por transcrição em tempo real. c) produzir antígeno da panteteina recombinante para produção de anticorpos e futura análise de expressão desta proteína. 3. Metodologia. As amostras de DNA serão obtidas individualmente de larvas e adultos das colônias suscetível e colônia REC. Estas serão submetidas a avaliações de transcrição quantitativa do transcrito da panteteinase em tempo real utilizando primers específicos para este gene e do gene controle. A produção de antígeno será obtida a partir de uma linhagem de Escherichia coli cepa BL21 transformada com o gene da panteteinase cultivada em meio Luria-Bertani (LB) sob indução com IPTG, segundo protocolo padrão. As proteínas recombinantes serão purificadas em resina Ni-NTA. Uma amostra de cerca de 1.5 mg será usada como antígeno, para imunização e produção de anticorpos policlonais através da empresa CélulaB (UFRS). 4. Resultados obtidos até março 2023. Em novembro 2022 houve substituição da bolsista e ingresso do atual aluno Yuri Silva levando a necessidade de treinamento e retomada dos ensaios de transcrição. Neste período o bolsista realizou todas as etapas de treinamento de biossegurança, de insetário para manipulação das colônias de Cx. quinquefasciatus, técnicas de extração e avaliação de RNA, ensaios de RT-qPCR e análise da expressão relativa de transcritos. Conforme descrito em relatório mais de cem amostras de RNA de larvas das duas colônias com avaliação quantitativa e qualitativa foram produzidas. Parte destas amostras, consideradas adequadas conforme critérios pré-estabelecidos (n= 38), foram utilizadas para a avaliação do perfil de transcrição. Após análise ao resultados válidos mostraram a expressão da panteteinase nas larvas S (n=15), com perfil variável em relação à amostra de referência. Já a expressão desta molécula nas larvas R (n= 9) foi significativamente inferior demonstrando um padrão de repressão e confirmando a hipótese deste estudo. A amostra de larvas já analisada (n= 24) será ampliada para 60 e em seguida será obtido o padrão de insetos adultos para a obtenção de um painel de transcrição de indivíduos das duas colônias nas fases jovem e adulta.

Bolsista: Mayara Paula Lacerda Vieira
Orientador(a): DANIELLE MARIA NASCIMENTO MOURA
Resumo: As doenças causadas por tripanossomatídeos patogênicos, que inclui gêneros como Trypanosoma e Leishmania, são geralmente crônicas, de difícil tratamento e causam, anualmente, danos à saúde e econômicos imensos a diversas comunidades. Estima-se que cerca de 1 bilhão de pessoas estejam vivendo em áreas de risco de contaminação por esses organismos, especialmente em países mais pobres e emergentes, incluindo o Brasil. O tratamento contra esses agentes causadores ainda é muito limitado, com drogas que podem se tornar tóxicas com o passar do tempo, assim, a produção de conhecimento sobre a biologia dos tripanossomatídeos pode iluminar novos caminhos para o desenvolvimento de fármacos e tratamentos menos agressivos. A biossíntese de proteínas é um processo vital para a expressão gênica e sobrevivência celular e sua primeira etapa, a iniciação da tradução, é altamente complexa e requer regulação por diversas proteínas conhecidas como Fatores de Iniciação Eucarióticos (eIFs). Dentre esses fatores, o complexo eIF4F tem papel fundamental no recrutamento do ribossomo para o mRNA. Os elementos do complexo eIF4F têm sido investigados como possíveis alvos terapêuticos, tanto em tripanossomatídeos quanto em outros organismos, e resultados de estudos com inibidores de componentes deste complexo se mostram promissores em estratégias de combate a doenças. O complexo eIF4F é formado por três subunidades: eIF4A (RNA helicase), eIF4E (proteína de ligação ao cap) e eIF4G (proteína-scaffold). Vários homólogos de cada subunidade foram descritos em tripanossomatídeos, com cinco eIF4Gs identificados em T. brucei, sendo conservados em outros outros membros da família. Dois deles, EIF4G3 e EIF4G4, são essenciais para a viabilidade celular e estão envolvidos na tradução ativa. Evidências experimentais também indicaram que a abundância desses dois homólogos de eIF4G é potencialmente regulada por mecanismos proteolíticos, como, por exemplo, os que envolvem a via ubiquitina-proteassoma. Para avaliar isso, buscamos gerar linhagens de células de T. brucei expressando versões mutantes dos fatores EIF4G3 e EIF4G4 que possam ser afetados em sua proteólise. Nos anos anteriores desse projeto, as sequências proteicas de EIF4G3 e EIF4G4 foram submetidas à predição de sítios de ubiquitinação in silico usando ferramentas online, como UbiSite, UbiPred e BDM-PUB e AlphaFold2. Os resíduos de lisina (K) com as melhores avaliações in silico foram selecionados para serem substituídos por alaninas através de mutagênese dirigida ao sítio. Um total de cinco sítios foram selecionados para EIF4G3 e para EIF4G4, os quais serão avaliados in vivo. Para isso vetores de expressão contendo os genes mutados serão transfectados por eletroporação em uma linhagem de T. brucei que expressa uma molécula de ubiquitina conjugada ao epítopo HA (UbHA). As linhagens celulares resultantes serão verificadas por western blotting para confirmar a expressão do fator mutante e da ubiquitina recombinante. O próximo passo será avaliar o fenótipo das linhagens e a possível interferência das mutações sobre a ligação covalente da ubiquitina aos fatores EIF4G3 e EIF4G4, o que será avaliado por meio de ensaios de imunoprecipitação com anti-HA, seguidos de western blotting. A abordagem pretende validar o potencial preditivo da análise in silico para identificar sítios de ubiquitinação em T. brucei. Nossos resultados também ajudarão a esclarecer os mecanismos que regulam os níveis citosólicos dos homólogos selecionados de eIF4G e seu impacto na regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos, podendo identificar pontos de controle importantes que podem ser explorados como alvos moleculares para o desenvolvimento de fármacos.

Bolsista: MARIANA LEONARDO TERRA
Orientador(a): NATALIA MOTTA DE ARAUJO
Resumo: Com um registro de 905.677 novos casos e 830.180 mortes em 2020, o câncer de fígado é o sexto tipo de câncer mais comum e a terceira causa de mortalidade associada ao câncer em todo o mundo, representando um grande problema de saúde global [IARC 2020]. No Brasil, quase 11.000 mortes foram registradas no ano de 2019 em virtude do câncer de fígado. O carcinoma hepatocelular (CHC) é o tumor maligno primário de fígado mais comum, sendo responsável por cerca de 90% dos casos. A progressão do câncer hepático envolve múltiplas etapas, incluindo inflamação (hepatite), fibrose, cirrose, e CHC, havendo forte influência de fatores virais e genéticos do hospedeiro. Os principais agentes etiológicos para o desenvolvimento do CHC são as infecções crônicas pelos vírus da hepatite B (HBV) e da hepatite C (HCV), que geram lesão hepática crônica, resultando frequentemente no desenvolvimento de cirrose hepática, sendo esta encontrada em mais de 80% dos casos de CHC. Devido ao curto tempo de evolução do CHC, geralmente o tumor se encontra avançado quando é feito o diagnóstico, fazendo com que a taxa de mortalidade desse tipo de câncer seja elevada. O bom prognóstico do CHC depende fundamentalmente da detecção precoce do tumor e, portanto, estudos que identifiquem possíveis marcadores de detecção precoce do CHC são de extrema importância. Várias linhas de evidência sugerem que o padrão de mutações somáticas em casos de CHC varia entre as diferentes regiões geográficas, muito provavelmente devido a fatores ambientais ou a diversidade genética do hospedeiro. O gene TERT (do inglês Telomerase Reverse Transcriptase) é responsável por codificar a porção catalítica da telomerase celular, que atua no reparo dos telômeros durante as divisões celulares. Sua expressão é necessária em tecidos que estejam em fase de proliferação, como os embrionários e os de regeneração, mas se encontra naturalmente desativada nos demais tecidos. Mutações somáticas do tipo substituição no gene TERT são frequentemente detectadas em uma região hotspot do promotor, entre elas, mudanças de citosina para timina podem ocorrer nas posições -146 e -124 [Horn et al., 2013], criando um sítio de ligação para fatores de transcrição, aumentando assim a expressão da telomerase. A reativação de TERT tem sido associada à transformação maligna de diferentes tipos celulares, incluindo os hepatócitos. De fato, a reativação do gene TERT através de mutações somáticas na região promotora pode ser encontrada em até 70% dos casos de CHC. Além disso, estudos têm demonstrado uma maior frequência dessas mutações em casos de CHC de etiologia por HCV do que HBV. Até o momento, não há estudos avaliando a prevalência de mutações no gene TERT em amostras de tecido hepático de pacientes com CHC no Brasil. Além disso, faremos a quantificação por pirosequenciamento da carga alélica das mutações -146C>T e -124C>T em TERT em amostras de tecido de fígado classificadas histologicamente nos diferentes graus da doença hepática (hepatite, cirrose e CHC), e avaliaremos se porcentagem de DNA genômico contendo mutações aumenta progressivamente de acordo com o grau da doença hepática. Esta análise será algo inédito na literatura e permitirá avaliar se a quantidade de DNA genômico mutado aumenta de acordo com o dano do tecido hepático. Os resultados obtidos no presente projeto contribuirão para a identificação de biomarcadores genéticos que poderão auxiliar na detecção precoce do CHC, bem como, na identificação de pacientes em alto risco para o desenvolvimento deste câncer.

Bolsista: CLEO PEREIRA DE ALMEIDA
Orientador(a): VERONICA MARQUES ZEMBRZUSKI
Resumo: A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa fatal causada por uma combinação de fatores genéticos e ambientais e disfunções relacionadas à idade. Seus sintomas clínicos, como fraqueza muscular progressiva, junto à atrofia e fasciculações, ocorrem devido ao comprometimento dos neurônios motores superior e inferior, e os do córtex frontal. A morte ocorre por paralisia respiratória em 2-5 anos. Mais de 20 genes já foram associados à patologia, embora mutações em um único gene expliquem a condição em apenas 15% dos pacientes. Entre tais genes, citamos três, que serão o foco de estudo deste projeto: VAPB: envolvido no transporte de proteínas para o retículo endoplasmático e sua ativação se dá quando proteínas mal dobradas se acumulam nesse compartimento celular. UBQLN2: envolvido com processos de ubiquitinação e degradação de proteínas no proteossomo, atuando na via de degeneração do neurônio motor. PFN1: envolvido na integridade do citoesqueleto celular e no transporte axonal, interferindo na rede de tubulinas. Encontrar biomarcadores genéticos é crucial para o diagnóstico, prognóstico ou estudos preditivos da ELA, pois permitem estratificar os pacientes e monitorar efeitos de tratamentos. Entre os objetivos específicos, e a metodologia a eles relacionada, temos: i. Avaliar as variáveis fenotípicas dos 22 casos de 14 famílias com a mutação VAPB P56S, já diagnosticada, a partir da análise dos registros médicos dos pacientes para caracterizar a heterogeneidade clínica da ELA (etapa não presencial); ii. Analisar os eletroferogramas do gene UBQLN2 de 164 pacientes, gerados por sequenciamento de Sanger da sua região codificadora pela aluna de doutorado vinculada ao projeto (etapa não presencial); iii. Realizar o rastreamento do gene PFN1 em 164 pacientes por sequenciamento de Sanger (etapa presencial no LGH-IOC). Para os objetivos ii e iii, as mutações encontradas serão descritas, comparando com os padrões observados em outras populações e analisando o impacto molecular das variantes novas na estrutura da proteína e seu potencial patogênico, através de ferramentas de bioinformática. Todos os pacientes foram diagnosticados com ELA através de exames clínicos e neurofisiológicos; a coleta de sangue, com posterior extração do DNA, foi feita após a assinatura do TCLE. Dentre os 22 pacientes com a mutação VAPB P56S, 9 são do sexo masculino, enquanto 13 são do sexo feminino. A idade média em que ocorreu o início dos sintomas foi de 45,2 anos (DP= 7,184), e todos apresentavam histórico familiar de ELA. O local de nascimento desses indivíduos se concentrou na região sudeste do Brasil; segundo os critérios de raça/cor (IBGE), observamos que 86,4% são brancos e 13,6% são pardos. Em relação às características clínicas, 2 pacientes apresentaram disfagia, 3, disartria e 16, câimbra. Nenhum dos indivíduos apresentou característica fenotípica que se sobreponha à demência frontotemporal. Embora seja comum observarmos pacientes P56S com protusão abdominal, apenas 7 indivíduos na nossa amostra apresentaram tal fenótipo. Treze pacientes apresentaram comorbidades, sendo a hipertensão e a obesidade as mais comuns. Sobre o local de início dos sintomas, grande parte da nossa amostra (n=20) teve início Espinhal (membros inferiores afetados), apesar da ausência de registro para dois pacientes. Uma vez que as regras para a volta das atividades presenciais dos alunos foram flexibilizadas, iniciamos a padronização dos experimentos do gene UBQLN2, para posterior análise dos eletroferogramas. Assim que a aluna se familiarizar com a rotina do laboratório e as técnicas de biologia molecular, serão iniciados os experimentos referentes ao rastreamento do gene PFN1. A partir do conhecimento das variantes que circulam na nossa população, poderemos correlacioná-las com o perfil clínico dos pacientes com ELA, o que irá permitir uma melhor compreensão da doença, bem como o desenvolvimento de métodos diagnósticos mais precisos e tratamentos mais eficientes.